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植物芥子酶防御系统为白花菜目植物特有,由芥子酶及其底物硫代葡萄糖苷组成。芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中,在受到病虫侵袭时,底物和酶相遇,硫代葡糖苷被降为有毒化合物,起防御作用。对其研究具有重要的意义。
在拟南芥中,Southern印迹表明存在3个芥子酶编码基因,其中只有两个基因TGG1和TGG2已被证明有活性,而TGG3是一个假基因。近年来,在拟南芥中又发现了三个芥子酶基因,即TGG4、TGG5和TGG6。TGG1和TGG2都在叶、子叶、茎和花器官中表达。TGG4、TGG5在根部特异表达。
本研究利用RNA干涉技术,初步研究了TGG4和TGG5基因的功能。根据TGG4、TGG5编码序列中特异靶序列设计siRNA序列。以拟南芥基因组DNA模板扩增7SL-4基因启动子和终止子,与siRNA序列连接并克隆到植物表达载体pBP5中,构建成了siRNA真核表达载体。利用花序浸泡法转化拟南芥,获得转基因植株。经Aada基因PCR检测初步证实外源基因已导入拟南芥的核基因组中。酶活测定的结果显示,TGG4、TGG5基因的表达受到了大部分抑制。这说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。
另外利用RT-PCR方法克隆了TGG4基因cDNA,连接并克隆到植物表达载体pBP6中,构建成过量表达载体。同时利用花序浸泡法转化拟南芥。
购买了T-DNA插入突变株,PCR鉴定出T-DNA插入位置。形态学观察结果表明,突变体没有明显的表型改变。说明TGG4和TGG5功能具有冗余性,单基因的突变不对拟南芥的生长发育产生影响。