PRRS病毒GP5的基因序列分析及其重组蛋白的应用研究

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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是以母猪流产及仔猪呼吸系统障碍为主要病征的传染病,病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。该病毒传染性强,而且感染机体后导致免疫抑制及各种并发症,给养猪业造成巨大危害和经济损失。病毒基因的变异也给防治增加了难度。糖基化囊膜蛋白5(GP5)是PRRSV的主要结构蛋白,具有结合细胞受体及诱导细胞凋亡等功能;而且该蛋白能诱导中和抗体产生,是新型疫苗设计的主要靶蛋白,因此在病毒的生理功能及PRRS的防治上具有重要作用。本研究对闽南地区流行的PRRSV毒株FJ-1的GP5编码基因ORF-5进行分子克隆,并对其核酸序列进行测定及分析,为该病的流行病学调查提供理论依据;同时,利用大肠杆菌在体外表达了GP5,并对重组蛋白的抗原特性进行研究;针对有些PRRSV疫苗未能对猪机体提供完全保护的情况,本研究还建立了一个间接ELISA体系来对疫苗免疫后的猪血清中的抗GP5抗体水平进行检测,来间接反应机体产生中和性抗体的水平,为针对该病的新型疫苗以及评价疫苗免疫效果的试剂盒的研制奠定基础。从福建省某种猪场采得患病猪肺病料,提取猪肺组织的总RNA并利用RT-PCR技术扩增出编码GP5的ORF5基因。目的DNA片段连接到pUcm-T载体上进行DNA序列测定。结果发现福建毒株FJ-1 ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸残基,与美洲型参考毒株VR-2332、Ch-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,因此推定FJ-1属于美洲型毒株。根据已分离的PRRSV毒株ORF5基因构建了系统发育进化树,从中可发现福建毒株FJ-1与其他美洲型毒株的同源性较低。设计引物从重组质粒pUcm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5编码序列tORF5,并在C末端带上6联组氨酸(6×His)标签编码序列,目的基因亚克隆构建成重组表达质粒pGEX-4T-tORF5,转化大肠杆菌后诱导表达。表达产物经过SDS-PAGE及Western-blot分析,证实为tGP5与谷胱甘肽转移酶(Glutathlone S-transferase, GST)的融合表达蛋白,分子量为41kDa,表达量占菌体总蛋白的15%,主要以包涵体形式存在。经过Ni离子树脂亲和层析纯
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