论文部分内容阅读
随着社会发展和人类生活水平的提高,人类对生命健康的关注越来越多,对重大疾病标志物的检测要求越来越高。重大疾病标志物的高灵敏检测不仅对疾病的早期诊断有重大意义,而且可以帮助临床医生采取最好的治疗措施。一些疾病标志物在细胞、血液或体液中的含量水平非常低,这在一定程度上影响了疾病的早期诊断和治疗。因此发展高灵敏、高选择性的检测分析方法尤为重要。电化学传感器尤其是电化学核酸适配体传感器因其特异性和灵敏度高、成本低、适用范围广等倍受关注。但是传统的电化学传感器在超微量疾病标志物的检测方面还存在一些困难,因此急需发展更为灵敏的电化学分析检测方法以满足当前疾病早期诊断的要求。近几年发展起来的各种信号扩增扩增策略如酶催化、纳米材料催化和DNA核酸扩增技术等能够显著提高传感器的灵敏度,为构建高灵敏的的电化学传感器提供了新的思路。本论文以核酸适配体为识别元件,采用电化学和电化学发光两种检测手段,结合各种信号扩增策略如功能性纳米材料的催化性能以及等温核酸扩增技术,成功构建了高灵敏、高选择性的电化学和电化学发光生物传感器,实现了对肿瘤标志物粘蛋白（MUC1）和8-羟基-2’-脱氧鸟嘌呤核苷（8-OH-dG）的高灵敏、高选择性检测。论文的主要内容包括以下三部分:1.基于目标物诱导催化发夹自组装与纳米模拟酶相结合,构建高灵敏MUC1电化学适配体传感器在本工作中,我们制备了具有类过氧化酶性质的PtPd双金属纳米粒子,该纳米粒子对H2O2氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的反应有很强的催化能力。在传感器的设计中,我们引入了三条发夹型DNA:HP1,HP2和PtPd NPs标记的HP3,通过三条发夹型DNA的巧妙设计,构建了一种目标物诱导催化发夹自组装高灵敏检测MUC1的适配体传感器。首先,目标物MUC1与含有适配体序列的HP1特异性结合形成MUC1-HP1复合探针,同时打破了HP1的发夹结构。MUC1-HP1复合探针进而引发了HP2和HP3在电极表面的催化发夹自组装,同时将PtPd NPs引入到电极表面。在此过程中,通过链取代反应,MUC1-HP1复合探针重新被释放出来,引发下一轮的催化发夹自组装,从而实现信号放大。基于PtPd NPs对H2O2氧化TMB反应的催化作用,通过测量反应产生的电流即可实现对MUC1的检测。该传感器通过目标物诱导的催化发夹自组装和链取代反应实现了目标物的循环使用,结合纳米PtPd双金属模拟氧化酶的高催化活性,为MUC1的灵敏检测提供了一种新的方法。该传感器对MUC1的检测限达到了16 fg/mL,低于已报道的某些电化学检测结果。这种设计克服了传统蛋白质检测中通过酶裂解或聚合进行蛋白质转化的缺点。另外,相对于天然酶分子,纳米过氧化酶灵敏度更高、稳定性更好,而且成本更低。本文为构建简单、无酶的电化学传感器检测蛋白质提供了一种新思路。2.基于目标物诱导多条DNA链释放和内切酶辅助信号放大策略,构建高灵敏检测8-OH-dG的电化学发光适配体传感器在此体系中,基于二茂铁Fc对Ru（bpy）32+/TPA电化学发光的猝灭作用,构建了灵敏检测8-OH-dG的“signal-on”式电化学发光适配体传感器。我们首先将适配体（Apt）固定到纳米磁球表面,每一条适配体分别和三条序列不同的DNA短链（pDNAs）杂交形成Apt-pDNAs复合物。在8-OH-dG存在下,适配体与8-OH-dG特异性结合形成紧密的G-四倍体结构,三种pDNAs被释放出来,这样相当于目标物的三倍放大。经过磁性分离后,pDNAs留在上层清液中用于电化学发光传感器的制备。二茂铁Fc标记的发夹DNA（Fc-HP）通过Au-S键固定到金电极表面,然后将pDNAs溶液滴涂到电极表面和Fc-HP进行杂交反应形成dsDNA。随后,限制性内切酶（Nt.AlwI）特异性识别并剪切dsDNA中的基体DNA序列,即Fc-HP被剪切成两部分,一部分留在电极表面,而包含了Fc的一部分序列离开电极表面。同时,三种pDNAs被释放,重新进入下一个杂交-剪切循环,实现信号放大。该传感器结合了电化学发光的高灵敏性和双重信号放大作用,对8-OH-dG的检测限达到了25 fM,实现了对尿样中8-OH-dG的高灵敏、高选择性检测。3.基于三重信号放大策略构建无标记、高灵敏电化学传感器用于8-OH-dG的检测同实验二相似,我们把目标物8-OH-dG转化为pDNAs,在这个过程中,目标物8-OH-dG相当于被放大了三倍,此为第一重信号放大。将磁性分离后的pDNAs用于电化学传感器的制备。释放出的pDNAs首先和固定在金电极上的发卡DNA1（HP1）反应打开其发夹结构,继而引发HP2和HP1的催化发夹自组装反应,通过链取代反应,pDNAs重新释放出来诱导下一轮的杂交和发夹自组装反应,从而实现第二重信号放大。然后裸露的HP2部分序列进一步引发发夹DNA3（HP3）和发夹DNA4（HP4）间的杂交链式反应,最终在电极表面形成长的双链DNA聚合物,实现第三重信号放大。这种长的双链DNA结构会吸附大量的带正电荷的电化学物质[Ru（NH3）6]3+,通过测量[Ru（NH3）6]3+氧化还原电流的大小即可实现对目标物8-OH-dG的检测。该适配体传感器在没有任何核酸酶的存在下,实现了三重信号放大,操作简单,成本低廉,为小分子等目标物的检测提供了一条新的设计思路。该传感器对8-OH-dG检测的线性范围为100 fM-10nM,检出限为24.34 fM,用于尿样中8-OH-dG的检测,结果满意。