【摘 要】
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背景:结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居第三位,近年来备受大家的关注。结肠癌发病隐匿,大多数结肠癌患者在初诊时已经伴随有不同程度的肿瘤转移。尽管早期手术和放化疗能在一定程度治疗和缓解结肠癌,但是对于已经伴有转移或者再复发的患者而言,治疗效果并不理想。结肠癌的发病机制十分复杂,导致结肠癌转移的机制更为复杂,对于结肠癌的转移机制研究将为我们靶向治疗结肠癌带来机遇。目的:本课题旨在研究YAP
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背景:结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居第三位,近年来备受大家的关注。结肠癌发病隐匿,大多数结肠癌患者在初诊时已经伴随有不同程度的肿瘤转移。尽管早期手术和放化疗能在一定程度治疗和缓解结肠癌,但是对于已经伴有转移或者再复发的患者而言,治疗效果并不理想。结肠癌的发病机制十分复杂,导致结肠癌转移的机制更为复杂,对于结肠癌的转移机制研究将为我们靶向治疗结肠癌带来机遇。目的:本课题旨在研究YAP抑制结肠癌细胞自噬的分子机制,为临床上治疗结肠癌寻找新靶点。在细胞水平上明确YAP上调Bcl-2转录表达的作用,进一步深入研究YAP通过上调Bcl-2的表达抑制结肠癌细胞的自发性自噬的分子机制。方法:通过免疫荧光和电镜观察在结肠癌SW620细胞系中不同YAP表达水平下自噬小体数量的变化;用Western blot检测接种结肠癌SW620过表达YAP和敲低YAP细胞系后的小鼠肿瘤蛋白中不同YAP表达水平对LC3II蛋白表达水平的影响;Western blot检测在结肠癌SW620细胞中瞬时转染改变YAP的表达水平后Bcl-2和LC3II的表达水平;Ch IP-q PCR检测YAP是否在Bcl-2启动子上富集;Dual-Luciferase检测在过表达YAP稳定细胞系中Bcl-2转录活性的变化;Western blot检测瞬时转染改变TEAD的表达水平后Bcl-2蛋白的表达水平的变化;CO-IP检测YAP与TEAD之间的相互作用;通过Western blot检测破坏YAP和TEAD的结合后Bcl-2、TEAD和YAP的表达水平。设计ɑ=0.05为显著性水平,运用t-检验和方差分析的统计学方法,采用SPSS 22.0进行统计学分析是否具有显著的差异。结果:免疫荧光结果显示,与对照组相比,结肠癌SW620敲低YAP细胞中自噬小体数量明显增加;电镜结果显示,与对照组相比,结肠癌SW620过表达YAP细胞中自噬小体的数量明显减少,敲低YAP细胞中自噬小体的数量明显增加;Western blot结果显示,接种结肠癌SW620过表达YAP细胞的裸鼠肿瘤蛋白中,LC3II蛋白表达水平明显降低,接种结肠癌SW620敲低YAP细胞的裸鼠肿瘤蛋白中,LC3II蛋白表达水平明显升高;Western blot结果显示,在结肠癌SW620细胞中瞬时过表达YAP后Bcl-2蛋白的表达水平升高,瞬时敲低YAP后Bcl-2蛋白的表达水平降低;Ch IP-q PCR结果显示,YAP在Bcl-2的启动子区域富集;Dual-Lu ciferase结果显示,与对照组相比,过表达YAP细胞的Bcl-2转录活性的变化明显升高;Western blot结果显示,在结肠癌SW620细胞中过表达TEAD后Bcl-2蛋白的表达水平升高,敲低TEAD后Bcl-2蛋白的表达水平降低;CO-IP结果显示YAP可以与TEAD的结合,共同发挥作用;Western blot结果显示,药物Vertepor fin作用后,破坏YAP与TEAD的相互作用,Bcl-2表达水平降低。结论:1.过表达YAP抑制结肠癌细胞自噬;敲低YAP促进结肠癌细胞自噬;2.YAP可能通过上调Bcl-2的表达抑制结肠癌细胞自噬;3.YAP可与转录因子TEAD结合调控Bcl-2的转录表达。
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