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肿瘤是危害人体健康的重大疾病之一,而食管鳞癌是世界常见的六大癌症之一,其恶性程度高,五年存活率低于5%,在发展中国家极为常见,尤其是在我国河南省林县,其发病率和死亡率均很高,但是其确切的发病机制仍不清楚,不过许多实验研究证明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是肿瘤治疗中的重要靶点之一,并且在前期对食管鳞癌的研究中已证实,mTOR/p70S6K (70kDa ribosomal protein S6kinase)信号通路是处于异常激活状态的。由于mTOR的分子比较大,与其作用的蛋白也相对较多,因此本课题在前期的实验研究基础上,选择mTOR/p70S6K下游通路的一个重要靶点p70S6K作为研究对象,利用免疫组化、Western blotting、RT-PCR、MTT等方法,探讨磷酸化的p70S6K (p-p70S6K)在食管鳞癌中的表达及其与食管鳞癌进程的相关性；并用shRNA干扰p70S6K的表达,检测干扰前后食管鳞癌EC9706细胞对雷帕霉素敏感性的变化,为进一步寻找治疗食管鳞癌新的分子靶点打下基础。方法1免疫组织化学收集临床食管鳞癌患者的组织标本,免疫组织化学法检测35例食管鳞癌患者的正常食管组织,癌旁组织和癌组织中mTOR和p-p70S6K的表达,并根据临床资料进行统计分析食管鳞癌中mTOR和p-p70S6K的蛋白表达与临床病理特征间的关系与意义。2Western blottingWestern blotting法检测食管鳞癌低分化细胞株EC1、EC9706和高分化细胞株Eca109中p70S6K及其磷酸化蛋白的表达情况,并观察在不同时间点雷帕霉素对二者表达的影响。3RT-PCR和MTTp70S6K-shRNA转染食管鳞癌EC9706细胞,用适当浓度的嘌呤霉素筛选出稳定表达株,RT-PCR法检测干扰效果；MTT法测定干扰前后雷帕霉素对细胞增殖的影响。4图像处理及统计学分析免疫组织化学的结果分析采用χ2检验,检验水准α=0.05；Western blotting和RT-PCR结果用IPP6.0进行灰度分析,实验重复三次,应用SPSS13.0软件采用单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05具有统计学意义。结果1食管鳞癌组织中mTOR及p-p70S6K的蛋白表达与临床生物学关系在食管鳞癌渐变过程中,mTOR蛋白在正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织及癌组织中的表达率依次增高,分别为20%(3/15)、46.7%(7/15)、62.9%(22/35),组间比较有明显差异(χ2=7.767,P<0.05),食管鳞癌组织中mTOR蛋白表达与肿瘤TNM分期密切相关(x2=9.121,P<0.01)；p-p70S6K在正常黏膜组织.癌旁不典型增生组织及癌组织中的表达率依次增高,分别为33.3%(5/15)、73.3%(11/15)、74.3%(26/35),其蛋白表达与肿瘤的淋巴结转移及TNM分期均密切相关(χ2=5.846及4.523；均P<0.05),组间比较有明显差异(x2=8.350,P<0.05),mTOR及p-p70S6K的表达呈正相关关系(γp=0.359,P=0.034)。2食管鳞癌细胞中p70S6K的表达及雷帕霉素对其的影响Westem blotting检测结果显示：p70S6K及p-p70S6K蛋白在三株食管鳞癌细胞中均有表达,p-p70S6K蛋白在低分化ECl和EC9706细胞中的表达明显高于高分化Eca109细胞的,雷帕霉素能够降低p-p70S6K的表达,并且具有时间依赖性。3干扰p70S6K后EC9706细胞对雷帕霉素的敏感性变化RT-PCR法测定结果显示转染后EC9706细胞中mRNA的水平降低,差别具有统计学意义(P<0.05)；MTT法测定结果显示p70S6K-shRNA干扰食管鳞癌EC9706细胞后细胞的增殖受到抑制,雷帕霉素处理后抑制作用增强,并且具有浓度依赖性。结论1mTOR及p-p70S6K在食管鳞癌组织中的表达远高于其在相对应的癌旁组织及正常食管组织,且二者与食管鳞癌的生物学行为关系密切。提示mTOR及p-p70S6K高表达的食管鳞癌具有更强的侵袭能力,检测食管鳞癌中两者蛋白的表达有利于我们进一步地了解食管鳞癌的生物学行为,为食管鳞癌的早期诊断和治疗提供一个新的分子靶点；2p70S6K磷酸化水平与细胞的分化程度有关,高分化的细胞中p70S6K磷酸化水平低,低分化的细胞中p70S6K磷酸化水平高；雷帕霉素能够抑制p-p70S6K的表达,并且具有时间依赖性；3下调p70S6K表达可使细胞对雷帕霉素的敏感性增强,且具有浓度依赖性。