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第一部分 大鼠脊髓星形胶质细胞的培养、纯化及鉴定目的 采用刚出生3天内SD大鼠脊髓制作并提取原代星形胶质细胞,进行原代培养,细胞传代并纯化,传至第3-4代后进行星形胶质细胞鉴定及纯度测定。方法 使用出生3天内的SD大鼠乳鼠脊髓组织,取材并胰蛋白酶消化制成细胞悬液,以107～109个/L细胞浓度,接种于底面积为75 cm2细胞培养瓶,培养瓶瓶底预先使用0.01%多聚左旋赖氨酸包被,放置于常规培养箱中(5%CO2,37℃,正常湿度)培养,培养基为DMEM/F12加入终浓度为10%-15%的胎牛血清,通过差速贴壁和摇床过夜等方法传代并纯化星形胶质细胞,培养1-2周后细胞传至3-4代,通过GFAP及DAPI免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞,为排除细胞传代干扰,我们统一使用传至第三代用于细胞实验研究,通过对比GFAP 阳性星形胶质细胞在所有DAPI染色细胞核中所占比例来检测培养的星形胶质细胞纯度。结果 GFAP染色呈阳性为星形胶质细胞,使用差速贴壁法与摇床等技术相结合可逐代纯化星形胶质细胞,GFAP阳性细胞在荧光染色中显示占有核细胞总细胞总数比例达到98%以上。结论 通过新生SD大鼠乳鼠脊髓可制作原代星形胶质细胞,使用差速贴壁法与摇床技术结合传代培养可逐代纯化星形胶质细胞,培养后可获得实验所需要的95%以上纯度星形胶质细胞。第二部分 脊髓星形胶质细胞OGD/R模型制作分组EPO与MPSS应用目的 制作符合实验要求的大鼠星形胶质细胞的OGD/R损伤模型,检测细胞增值活性、细胞凋亡及凋亡因子表达变化,建立细胞缺血再灌注损伤损伤模型。EPO与MPSS单独应用及联合应用对体外培养脊髓星形胶质细胞水肿后AQP4mRNA及蛋白表达变化,探讨其联合应用对脊髓缺血水肿损伤是否有协同作用。方法 传代纯化后的脊髓星形胶质细胞,采用经典细胞OGD/R损伤模型(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD)模拟脊髓缺血再灌注过程,首先利用国内外通用的经典OGD技术诱导大鼠脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺损伤,模拟“脊髓缺氧缺血”状态,原培养液全部换成低糖(0.5 mmol/L)DMEM培养液,置于特制缺氧细胞培养箱内充以99.9%氩气,氧气含量低于0.1%,37℃正常湿度下培养4小时,缺氧缺糖4小时后恢复原培养环境(正常培养基,37℃、95%空气和5%CO2正常潮湿环境的培养箱)模拟“脊髓缺氧缺血后再灌注”状态,按正常组、生理盐水对照组、EPO(10 u/ml)、MPSS(10 ug/ml)、MPSS(10 ug/ml)和 EPO(10 ug/ml)分组进行药物及对比剂干预,于干预后0.5 h、1h、1.5 h、2 h、3 h、6 h、12 h、18 h等时间点取标本进行检测,确定不同分组干预后AQP4mRNA及蛋白变化的时间-变化曲线,选取效果明显的时间点AQP4mRNA0.5h,AQP4蛋白12h;按原培养环境继续培养至选定时间点12h(OGD4/R12h)进行分组实验。观察各分组:1、常规倒置显微镜观察细胞形态在损伤前后变化;2、应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测不同分组星形胶质细胞的损伤前后细胞的增殖活性,LDH漏出率检测不同分组细胞膜的损伤程度,并同时损伤细胞的流式检测细胞凋亡率及western检测凋亡相关蛋白(caspase-3、8等)的表达;3、PCR检测星形胶质细胞AQP4 mRNA表达;4、western检测星形胶质细胞AQP4蛋白表达。结果 1、OGD/R损伤4小时后部分细胞胞突变短,胞体变小,少数细胞坏死并脱落,漂浮于培养基中,细胞萎缩。复氧12h后细胞胞体变大,基本恢复损伤前形态,极个别死亡细胞漂浮在培养基中;2、MTT检测结果显示:氧糖剥夺损伤后星形胶质细胞增殖活性明显较损伤前降低,恢复培养基模拟再灌注氧糖剥夺/复氧12h后细胞增殖活性明显升高,差异均有显著统计学意义;单独应用EPO和生理盐水对照组对细胞增殖、凋亡检测差异无统计学意义(P>0.05),单独MPSS对损伤细胞增殖、凋亡差异均有统计学意义(P<0.05);LDH漏出率检测细胞膜的损伤程度药物干预后均差异显著,检测氧糖剥夺/复氧损伤前后细胞的凋亡率及凋亡相关蛋白的表达,均提示差异有显著统计学意义(P<0.05),OGD/R损伤模型成功建立。EPO和MPSS联合应用对细胞增殖、凋亡、细胞膜稳定性等恢复有明显统计学差异(P<0.05);联合EPO和MPSS应用优于任何一种药物单独应用,统计学分析显示两者之间有协同作用;3、PCR检测示:损伤组较正常组星形胶质细胞AQP4mRNA表达显著降低,恢复培养基再灌注后较损伤组星形胶质细胞AQP4mRNA表达升高,差异有显著统计学意义(P<0.01),药物作用组较对照组及损伤组星形胶质细胞AQP4mRNA表达升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。EPO/MPSS以及联合用药均抑制星形胶质细胞AQP4 mRNA及蛋白表达降低;4、western检测损伤组较正常组星形胶质细胞AQP4蛋白表达降低,复氧后较氧糖剥夺损伤后星形胶质细胞AQP4蛋白表达升高,药物干预组均较氧糖剥夺损伤后星形胶质细胞AQP4蛋白明显升高,差异有统计学差异(P<0.05)。药物联合应用显著促进AQP4蛋白表达升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论 通过上述经典OGD/R模型模拟脊髓缺血再灌注损伤,统计分析可见建立原代星形胶质细胞OGD/R损伤模型成功,星形胶质细胞损伤前后AQP4mRNA和蛋白表达以及细胞增殖、细胞膜稳定性、细胞凋亡均有统计学差异。合用EPO和MPSS对星形胶质细胞水肿损伤保护作用优于单独应用MPSS或EPO。统计分析两者联合应用对细胞AQP4mRNA及蛋白变化有协同作用。第三部分 EPO与MPSS有关PKC信号通路的研究目的 研究应用EPO与MPSS联合应用对体外培养脊髓星形胶质细胞水肿损伤的干预,并探讨其对脊髓缺血水肿损伤的作用机制。探讨阻断剂Ro 31-8220预处理阻断PKC通路对体外培养脊髓星形胶质细胞损伤后AQP4mRNA及蛋白表达的不同药物作用的影响。方法 采用3代星形胶质细胞,在药物干预前应用PKC通路阻断剂Ro 31-8220(0.1umol/L)预干预,分组通过OGD模型4小时后即恢复培养基并应用药物0.5 h收集细胞,PCR技术测定细胞AQP4 mRNA表达的变化。作用12h后Western bloting技术测定细胞AQP4蛋白变化,MTT法测定细胞活性,细胞膜的损伤程度使用LDH漏出率检测,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,PCR、Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果 脊髓星形胶质细胞损伤后,EPO和MPSS联合应用对细胞增殖、凋亡等恢复有明显统计学意义,应用阻断剂Ro 31-8220后,MPSS对星形胶质细胞AQP4mRNA及蛋白表达作用被显著抑制,EPO对星形胶质细胞AQP4mRNA及蛋白表达作用有抑制作用,MPSS与EPO联合应用显著抑制PKC通路。结论MPSS与EPO通过PKC通路影响AQP4表达,MPSS和EPO两者联合应用可能与PKC通路抑制有关。