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苏云金芽胞杆菌(Bt)是世界上应用最广泛的微生物农药,主效杀虫活性物质是其芽胞期产生的杀虫晶体蛋白(Cry)。随着Bt微生物农药使用量不断增长,农业害虫对Bt抗性问题也逐渐显现,目前针对“农业害虫如何抵御Bt杀虫晶体蛋白”这一问题的研究还不深入,其分子机制也不太清楚。近几年的研究发现,害虫的能量代谢与抵御Bt杀虫晶体蛋白的防御反应有相关性,腺苷酸(AMP)活化蛋白激酶(Adenosine Monophosphate(AMP)-activated Protein Kinase,AMPK)几乎存在于所有生物细胞中,其主要功能为细胞的能量调控中心,AMPK与害虫抵御Bt杀虫晶体蛋白防御反应的联系未知,其作用方式也不清楚,针对这个科学问题我们展开了以下研究。1.秀丽隐杆线虫AMPK介导的抵御苏云金芽胞杆菌Cry5Ba毒素的研究本研究以杀线虫晶体蛋白Cry5B和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为模型,发现AMPK参与了秀丽隐杆线虫抵御Bt杀虫晶体蛋白Cry5B的防御过程。具体研究结果如下:(1)Cry5Ba晶体蛋白能激活线虫AMPK通过分析野生线虫N2喂食Cry5Ba后转录组数据,发现AMPKα2亚基的转录水平呈现上调表型,通过液质联用仪(LC-MS)发现线虫能量代谢失衡,体内AMP/ATP比例明显升高;通过Western Blot实验证实了AMPKα2亚基蛋白的第172位苏氨酸(Thr-172)被磷酸化,从而证明Cry5Ba晶体蛋白可以激活AMPK。(2)AMPK参与线虫抵御Cry5Ba过程通过不同Cry5Ba浓度下测定线虫N2和AMPKα2亚基突变体aak-2(ok250)的生长抑制率和生存率,发现突变体aak-2(ok250)对Cry5Ba毒素更加敏感;当激活剂AICAR激活AMPK后,线虫对Cry5Ba产生抗性,而突变体aak-2(ok524)表型不明显;用线虫不同组织特异性启动子介导aak-2基因的表达并回补aak-2(ok524)突变体,发现肠道特异启动子介导aak-2基因的表达可以恢复aak-2(ok524)突变体对Cry5Ba毒素的抗性表型。通过Cry5Ba毒素短时冲击试验,发现AMPK可以保护线虫。本研究发现了AMPK参与线虫抵御Cry5Ba防御反应。(3)ampk参与调控下游多种防御cry5ba反应我们利用转daf-16基因线虫tj356(isdaf-16::gfp)发现ampk可以通过调控线虫转录因子daf-16来抵御cry5ba毒素;利用qrt-pcr技术证实ampk参与调控p38mapk信号通路,c-junmapk信号通路,错误折叠蛋白质反应,自噬等线虫抵御cry5ba毒素的防御反应;同时还证明cry5ba可以通过ampk激活秀丽隐杆线虫的自噬怎么证明自噬的。本研究证实了ampk可以调控的下游参与抵御cry5ba毒素的多种防御反应信号通路。(4)cry5ba蛋白晶体可以诱发线虫的拒食反应通过测定线虫喂食吞咽频率和吞入线虫体内芽胞数目;发现cry5ba晶体喂食野生型线虫n2后其吞咽频率和进入体内芽胞数目有明显的降低;从而证实了cry5ba晶体蛋白可以引起线虫拒食行为。2.新型杀线虫粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)的分离及鉴定在饲养线虫时,有时候会发现大量秀丽隐杆线虫不正常死亡,我们为了寻找其原因,试着从线虫尸体中分离病原菌,我们发现并鉴定了一株具有生物防治潜力的线虫病原菌alcaligenesfaecaliszd02。根结线虫对农业生产危害严重,它几乎可以侵害所有农作物;根结线虫大部分时间寄生于植物的根部,造成它比地上害虫更加难以防治。防治根结线虫主要依赖化学农药,效果往往不佳且污染环境。细菌防治根结线虫具有巨大的潜力,它可以避免施用化学农药引起的环境问题。目前报道可以毒杀根结线虫的细菌资源还比较稀少,例如:bacillus,pseudomonas和pasteuria。因此发掘新型杀线虫的细菌资源具有巨大的经济价值和现实意义。(1)粪产碱菌zd02的分离鉴定从秀丽隐杆线虫尸体中分离到一株对秀丽隐杆线虫有毒杀活性的菌株zd02,随后发现该菌株可以抑制秀丽隐杆线虫的生长发育,加速秀丽隐杆线虫的死亡;克隆该菌16srrna基因并测列发现该菌株为粪产碱菌(alcaligenesfaecalis);我们还证实该菌株发酵液能毒杀秀丽隐杆线虫和根结线虫。(2)胞外丝氨酸蛋白酶(esp)是粪产碱菌zd02杀线虫毒力因子本研究测定了该菌株的基因组,生物信息学分析发现该菌株基因组中含有胞外丝氨酸蛋白酶(Esp),RT-PCR证实esp基因可以在A.faecalis ZD02发酵过程中转录,Esp蛋白质具有丝氨酸蛋白酶的活性;生物测定发现Esp蛋白质对秀丽隐杆线虫和根结线虫均有毒杀活性,其对秀丽隐杆线虫和根结线虫的半数致死浓度(LC50)分别是260.45μg/m L和211.50μg/m L。通过观察喂食粪产碱菌ZD02及毒力因子Esp蛋白质的秀丽隐杆线虫肠道,发现两者均可以破坏线虫肠道。(3)粪产碱菌ZD02抑制秀丽隐杆线虫的防御反应通过QRT-PCR技术,我们证实粪产碱菌ZD02下调秀丽隐杆线虫溶菌酶和抗菌肽等防御效应因子的转录,主要有:spp-1,abf-2,lys-2,lys-7,F08G5.6,tbn-2。随后我们还证实该菌可以抑制秀丽隐杆线虫的一些防御病原菌的信号通路,主要包括:Daf-2/Daf-16免疫通路,丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)(p38-MAPK)免疫通路,c-Jun氨基端蛋白激酶(c-Jun MAPK)免疫通路,自噬和未折叠蛋白应答(UPR)途径;