第一部分genistein对体外培养软骨细胞IL-1β、NO及胶原蛋白多糖的表达的影响目的：体外培养软骨细胞，并对培养的软骨细胞药物进行干预，检测IL-1β、NO及Ⅰ、Ⅱ型胶原、蛋白多糖的表达，探寻genistein对软骨细胞在细胞分子水平的影响及其可能机制。方法：对软骨细胞进行原代及传代培养，通过对培养细胞形态学及甲苯胺蓝染色观察，选择适合传代软骨细胞，应用genistein干预后1、2、3、4天时，对细胞培养上清液应用ABC-ELISA法检测培养IL-1β水平，通过亚硝酸盐测定检测培养上清液NO水平；应用RT-PCR、ICC及甲苯胺蓝染色观察比较genistein干预对体外培养软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原在转录和翻译水平、蛋白多糖的表达的变化。结果：倒置相差显微镜观察见原代分离的软骨细胞24h后大部分细胞沉降于培养瓶壁上，72h后完全贴壁。形态学、甲苯胺蓝染色显示3代以内体外培养软骨细胞保持细胞表型的稳定。3代以后细胞的分泌、增殖能力下降，细胞传代周期延长。体外培养软骨细胞传代培养后，三代以内的细胞具有较好的活性：空白对照组上清液中IL-1β保持低水平表达，LPS刺激组以及LPS刺激+genistein干预组上清液中IL-1β的表达水平之间比较无差异，并随时间延长呈现逐渐上升的趋势；空白对照组不产生NO，在LPS刺激下可产生NO，且随着时间的延长，NO水平逐渐增加，在genistein干预后上清液NO的水平有一定的下降，下降的水平与genistein干预浓度和时间相关。甲苯胺蓝染色对照组单层细胞正染成浅蓝色，核仁呈深蓝色；集落样生长和多层生长区细胞和细胞外基质异染成紫红色，核正染成深蓝色，边缘部位异染不及中心区域。LPS刺激组以浅蓝色为主，部分细胞呈核负染，ECM染色变浅；20μg／ml及25μg／ml浓度genistein干预组细胞染色和正常软骨细胞接近。RT-PCR、ICC结果显示空白对照组软骨细胞未见明显表达Ⅰ型胶原，LPS刺激后Ⅰ型胶原表达随着培养时间的增加又逐渐增高的趋势，LPS刺激+不同浓度genistein干预后Ⅰ型胶原表达趋势类似于LPS刺激组，表达水平低于LPS刺激组细胞，其中20μg／ml及25μg／ml浓度genistein干预后Ⅰ型胶原表达水平与LPS刺激组比较，P＜0.05，具有统计学意义。空白对照组软骨细胞Ⅱ型胶原表达随着培养时间增加有逐步增加的趋势，LPS刺激后Ⅱ型胶原mRNA表达的增加趋势明显低于空白对照组，各检测时间表达水平，P＜0.05，具有统计学意义；LPS刺激+不同浓度genistein干预Ⅱ型前胶原表达检测显示：20μg／ml及25μg／ml浓度genistein干预后，Ⅱ型胶原的表达趋势有恢复，各检测时间表达水平与LPS刺激组比较，P＜0.05，具有统计学意义。结论：体外培养软骨细胞传代培养后，三代以内的细胞具有较好的活性，能保持细胞的表型，是理想的实验对象。LPS刺激及genistein干预后比较上清液IL-1β、NO水平结果提示，genistein能有效的降低NO的表达水平，而对IL-1β的表达水平不能产生有效的抑制；对软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原在转录和翻译水平、蛋白多糖的表达方面，genistein能有效恢复Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达，降低异常Ⅰ型胶原的表达水平，阻止LPS刺激后体外培养软骨细胞反分化的趋势，继续维持正常表型。第二部分genistein对OA模型软骨MMP-1、13mRNA、IL-1β及NO表达的影响目的：建立骨关节炎的动物模型，检测IL-1β、NO在动物模型关节液中的变化规律，了解MMP-1、13在OA发病发展中的作用，以及genistein对OA关节软骨MMP-1、13和IL-1β、NO表达的影响。方法：参照Hulth法建立动物模型，于不同时期进行X线、显微解剖检查进行分级，RT-PCR检测MMP-1、13mRNA，应用ABC-ELISA法检测培养IL-1β水平，通过亚硝酸盐测定检测关节液NO水平在造模不同时期关节软骨中，以及应用受体酪氨酸酶抑制剂genistein干预后在不同时期的表达情况。结果：4周后可见关节面尚平整，内侧关节间隙增宽，软骨下骨硬化，密度增高，未见明显骨赘形成，8周时可见内侧关节间隙明显狭窄，关节面不平，软骨下骨硬化，髁关节面也不平整，边缘可见骨赘形成。12周时可见关节肥大，关节间隙极度狭窄，内侧平台塌陷，大量骨赘形成，软骨下骨密度不均，明显硬化。4周时，对照组与各组不同浓度genistein干预组比较MMP-1、13mRNA，呈低表达水平，各组之间两两比较无差异；8周时，0.3mg／kg、0.4mg／kg、0.5mg／kg浓度genistein干预组中，MMP-1、13mRNA的表达量增加明显较对照组降低，比较差异，P＜0.05，具有统计学意义；12周时各组MMP-1、13mRNA的表达均较8周降低，但是仍高于4周，0.3mg／kg、0.4mg／kg、0.5mg／kg浓度genistein干预组与对照组之间比较，P＜0.05，具有统计学意义。随着造模时间的增加，各组关节液中IL-1β水平持续升高，各组组内不同时间IL-1β比较差异，P＜0.05，具有统计学意义，同一时间各组组间比较差异，P＞0.05，无统计学差异；各组关节液中NO水平持续升高，各组组内不同时间NO比较差异，P＜0.05，具有统计学意义，同一时间比较差异，0.3mg／kg、0.4mg／kg、0.5mg／kg浓度genistein干预组与对照组之间，P＞0.05，无统计学差异；0.3mg／kg、0.4mg／kg、0.5mg／kg浓度genistein干预组与对照组比较，P＜0.05，具有统计学意义。结论：参照Hultll法建立兔OA动物模型，在手术后4周、8周以及12周时的关节X线、显微解剖所见符合早期、中期和晚期骨关节炎的表现，可以作为不同病理阶段的骨关节炎动物模型进行下一步的实验研究。MMP-1、13在骨关节炎软骨中的过表达打破了基质合成分解的动态平衡，造成ECM降解增加，尤其是Ⅱ型胶原，软骨的完整性被破坏。应用0.3mg／kg、0.4mg／kg、0.5mg／kg浓度的genistein干预后，能够显著降低MMP-1、13mRNA在中期和晚期骨关节炎中的过表达，在体内实验中检测IL-1β、NO的表达水平，结合第一部分体外细胞培养结果，提示了genistein能够在一定浓度下在体内同样能降低NO的表达，而正是NO水平的降低引起了MMP_s分泌水平的降低，这种变化在一定程度上延缓了OA的发病。第三部分genistein对OA模型动物关节软骨组织形态和基质胶原表型表达的影响目的：在建立OA动物模型基础上进一步观察genistein对不同时期OA关节软骨的组织形态学、超微结构以及基质胶原表型表达的影响。方法：各时间点关节软骨HE／SOFG双染色观察与Mankin评分结果，免疫组织化学方法染色比较观察和检测Ⅰ、Ⅱ型胶原分布及阳染面积比例(PAR)，透射电镜(TEM)比较观察细胞超微结构的变化。结果：各个时间点实验组Mankin评分均优于对照组，比较差异，P＜0.01具有显著统计学意义；Ⅰ型胶原染色各组组内PAR数值4周、8周、12周两两比较差异，P＜0.05，具有统计学意义，且PAR随着造模时间的增加而增加；不同造模时间实验组与对照组PAR数值比较差异，P＜0.05，具有统计学意义，实验组PAR低于对照组；Ⅱ型胶原染色各组组内PAR数值两两比较差异，P＜0.05，具有统计学意义，且PAR随着造模时间的增加而减少；不同造模时间实验组与对照组PAR数值比较差异，P＜0.05，具有统计学意义，实验组PAR高于对照组。TEM显示：4周时实验组呈正常或轻度损伤表现，对照组轻到中度损伤；8周时实验组轻到中度损伤，对照组中到重度损伤；12周时实验组中到重度损伤，对照组呈重度损伤。结论：各个时间点实验组Mankin评分优于对照组，IHC结果显示genistein能部分增加促进Ⅱ型胶原合成，代偿Ⅱ型胶原的降解，同时genistein能够延缓异常Ⅰ型胶原的表达。TEM观察在超微结构水平提示genistein降低软骨损伤后的损害程度。但是组化水平表现为典型的中、晚期OA，提示应用genistein对于延迟关节软骨在组织-组化水平的退变是有效的，但是尚不能最终阻止软骨退变和OA发生发展的进程。