【摘 要】
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泛素连接酶是真核生物高度保守的泛素-蛋白酶体途径的核心。作为一种新型泛素连接酶,ARI(Ariadne)蛋白在动物的生长发育和免疫应答过程中起着重要作用,但其在植物中的功能未明且研究极少。本研究首先综合多种生物信息学方法对OsARI2及其家族基因的结构特点和可能功能进行研究和预测,然后通过RT-qPCR方法对OsARI2的表达情况进行分析,进一步再以OsARI2过表达和CRISPR/Cas9敲除水
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(31471574); 江苏省作物遗传生理重点实验室开放课题(YCSL202109); 植物功能基因组学教育部重点实验室开放课题(ML202104);
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泛素连接酶是真核生物高度保守的泛素-蛋白酶体途径的核心。作为一种新型泛素连接酶,ARI(Ariadne)蛋白在动物的生长发育和免疫应答过程中起着重要作用,但其在植物中的功能未明且研究极少。本研究首先综合多种生物信息学方法对OsARI2及其家族基因的结构特点和可能功能进行研究和预测,然后通过RT-qPCR方法对OsARI2的表达情况进行分析,进一步再以OsARI2过表达和CRISPR/Cas9敲除水稻株系为材料,对OsARI2的功能进行初步探究。主要结果如下:1.系统进化树分析表明,OsARI2与AtARI2进化关系最近,其次与OsARI1-1/2/3亲缘关系较近。结构域分析表明,OsARI2及其家族蛋白都没有完整的RBR(RING between RING fingers)结构,而应为类RBR型泛素连接酶。顺式作用元件分析表明,OsARI2及其家族基因主要与光响应、脱落酸等植物激素响应和厌氧等非生物胁迫响应相关。基因表达分析表明,OsARI2及其家族基因的表达可受到氮饥饿、茉莉酸和脱落酸等信号调控。基因共表达网络分析表明,OsARI2可能与G蛋白和氮饥饿响应等信号途径相关,但与其他家族基因间没有共表达关联。蛋白互作网络分析表明,OsARI2及其家族蛋白可能作为泛素连接酶参与水稻生长发育的调控。2.在水稻种子萌发过程中,OsARI2表达量呈先上升后下降的趋势。在水稻幼苗中,OsARI2在根和茎中的表达量随着苗龄的增加而上升,但在叶中表达量则有所下降。在水稻成株中,OsARI2的表达量在始穗期至完熟期的叶和茎中都相对较高。在水稻籽粒灌浆过程中,OsARI2表达量从灌浆开始逐渐下降,在花后23天达到最低值之后则有所上升。3.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了 6种不同变异的OsARI2突变材料,根据编辑位点变异情况可分成三大类型。其中,变异类型一仅是30位天冬氨酸和31位谷氨酰胺缩变成谷氨酸,因此推测该变异类型对OsARI2蛋白结构和功能的影响有限,而其他两种变异类型都是导致蛋白编码在RING结构域前终止,因此这两种变异类型可能都导致OsARI2蛋白功能的完全失活。4.OsARI2过表达和敲除水稻在剑叶、穗和籽粒等多个器官性状上都有株系与野生型(WT)存在显著性差异,这提示OsARI2可能影响了这些器官的生长发育。5.OsARI2过表达水稻种子萌发规律与WT类似,而敲除水稻种子萌发出现明显地延迟,且对外源脱落酸处理更敏感。这揭示OsARI2可能通过依赖脱落酸信号途径参与调控水稻种子萌发过程。6.与WT相比,OsARI2过表达水稻7天龄幼苗根数和平均根直径都没有差异,但最长根长、总根长和根尖数均减少,而敲除水稻则表现为根数、平均根直径、总根长和根尖数均减少,但最长根长增加。这提示OsARI2可能参与调控水稻幼苗根系的生长过程。综上所述,OsARI2是一种类RBR型泛素连接酶,其参与调控水稻种子萌发和幼苗根系生长等过程,还可能与脱落酸等植物激素信号途径相关。这可为进一步研究OsARI2的功能提供方向。
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