论文部分内容阅读
目的:研究Id2(inhibitor of DNA binding 2)对小鼠坐骨神经损伤后轴突再生及功能恢复的影响,并初步探讨其作用机制。方法:1)AAV9病毒脊髓前角注射和坐骨神经损伤:取成年小鼠,麻醉,固定T13胸椎,暴露脊髓;将AAV9-GFP或AAV9-Id2-Flag-GFP立体定位注射至双侧脊髓前角;2w后,再次麻醉小鼠,暴露双侧坐骨神经进行夹伤;损伤后1h验证夹伤处GFP~+轴突是否完全断裂;损伤后1d肌电图(EMG)检测确认神经肌肉传导是否完全中断。2)坐骨神经轴突再生分析:按上述方法进行AAV9-GFP或AAV9-Id2-Flag-GFP注射及坐骨神经损伤;损伤后2w分析坐骨神经内GFP~+轴突再生数量和距离、腓肠肌内GFP~+纤维数量以及腓肠肌内神经肌肉接头形成情况。3)动物功能恢复情况分析:在术前进行Catwalk步态分析留取基础值;按上述方法进行AAV9-GFP或AAV9-Id2-Flag-GFP注射及坐骨神经损伤;损伤后30d,进行Catwalk步态分析和EMG记录;组织学分析腓肠肌内神经肌肉接头数量。4)神经元突起生长实验:分离E18小鼠皮层神经元,加入LV-shControl或LV-shNgn2慢病毒并接种,培养2d后再加入Ad-Id2DBM或Ad-EGFP,继续培养3d,测量神经元突起长度。结果:1)动物模型的建立和验证:在GFP及Id2组小鼠相应节段脊髓双侧前角均可见GFP~+的神经元及大量突起,且很多为ChAT~+的运动神经元;Id2组GFP~+的神经元同时还表达Flag,提示Id2-Flag蛋白融合表达;坐骨神经内可见大量GFP~+的纤维;在损伤后1h,夹伤处GFP~+纤维全部断裂;损伤后1d进行EMG检测未看到电活动。2)损伤后2w坐骨神经轴突再生情况:GFP组和Id2组均可看到大量GFP~+纤维再生,但在损伤下游3 mm以外,Id2组GFP~+再生纤维显著多于GFP组;Id2组腓肠肌内也可见许多GFP~+纤维,而GFP组动物腓肠肌内仅见到极少量GFP~+纤维;Id2组腓肠肌内已可见少量神经肌肉接头形成,而GFP组未见有神经肌肉支配。3)损伤后30 d动物功能恢复情况:Catwalk分析显示坐骨神经损伤后GFP组小鼠的脚印面积(print area)较损伤前明显减小,且左右后肢脚间距(Bass of support)较损伤前显著增宽,与GFP组相比,Id2组小鼠的脚印面积增大,脚间距缩短;EMG检测显示,与GFP组相比,Id2组小鼠神经肌肉动作电位的振幅明显增高,且潜伏期明显缩短;组织学染色结果显示Id2组腓肠肌内神经肌肉接头数量较GFP组显著增多;4)免疫组化染色显示,GFP组脊髓神经元基本不表达Neurogenin2(Ngn2),而Id2组脊髓前角GFP~+神经元的Ngn2表达明显上调;进一步的体外神经元突起生长试验采用shRNA敲减Ngn2的表达可显著阻断Id2对轴突生长的促进作用。结论:1)在脊髓运动神经元中过表达Id2能加速坐骨神经损伤后轴突再生;2)Id2可促进坐骨神经损伤后神经对后肢肌肉的再支配,促进运动神经传导速度和神经肌肉动作电位幅度的恢复,以及促进后肢运动功能的恢复;3)Id2可上调神经元中Ngn2蛋白的表达,提示上调Ngn2可能是Id2促进轴突生长和再生的潜在机制。