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研究背景:游离脂肪酸（Free Fat Acid,FFA）异常升高诱导的代谢性炎症在胰岛β细胞损伤中发挥了重要作用,Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）的激活是FFA触发代谢性炎症的途径之一。但目前对改善代谢性炎症尚缺乏靶向干预措施,TLR4介导的β细胞代谢性炎症损伤机制仍未阐明。我们前期研究发现抑制TLR4活性或表达可拮抗高脂饮食所致的胰岛素抵抗,减轻脂毒性损伤的β细胞功能障碍,本研究进一步探讨敲除TLR4（Toll-like receptor 4 knockout,TLR4KO）对高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰腺蛋白质组学的影响,以及基于胰腺蛋白质组学的结果,研究节点蛋白精氨酸琥珀酸合成酶1（arginosuccinate synthetase 1,Ass1）在TLR4介导的β细胞代谢性炎症损伤中的作用。研究目的:本研究分为三个部分进行:1研究TLR4KO对高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛功能障碍与胰腺蛋白质组学的作用。2研究TLR4在脂毒性影响β细胞功能过程中对Ass1及其下游精氨酸生成的影响。3探讨Ass1以及精氨酸对脂毒性损伤的β细胞的作用。研究方法:1研究TLR4KO对高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛功能障碍与胰腺蛋白质组学的作用1.1 TLR4KO对肥胖大鼠胰岛功能障碍的作用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除大鼠TLR4基因构建TLRKO大鼠模型,高脂饲料喂养大鼠16周构建肥胖大鼠模型。Lee’s指数评估肥胖模型;腹腔葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）和胰岛素耐量试验（insulin tolerance test,ITT）及稳态模型β（homeostasis model assessmentβ,HOMA-β）评估胰岛β细胞功能;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清胰岛素和炎症因子水平（IL-1,IL-6,TNF-α）;苏木精-伊红染色法（HE）观察胰岛炎症浸润情况;免疫荧光（IF）观察胰岛结构并分析α、β细胞的比例变化;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测胰腺组织细胞凋亡。1.2 TLR4KO对肥胖大鼠胰腺蛋白质组学的影响构建TLR4KO和肥胖大鼠模型,同位素标记的相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ）定量检测胰腺蛋白质组学;ELISA检测胰腺Ass1及精氨酸、瓜氨酸含量;硝基还原酶法检测血清一氧化氮（NO）水平。2研究TLR4在脂毒性影响β细胞过程对Ass1及其下游精氨酸生成的影响2.1脂毒性影响β细胞功能过程中Ass1及精氨酸的变化棕榈酸（palmitic acid,PA）1mmol/L干预β-tc6细胞24小时,建立脂毒性损伤的β细胞模型。ELISA检测Ass1、磷酸化Ass1含量及胰岛素分泌水平（BIS、GSIS）,流式细胞技术检测细胞凋亡。2.2 TLR4对脂毒性损伤的β细胞Ass1及精氨酸的影响使用TLR4激动剂脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）1ug/ml或TLR4抑制剂瑞沙托维（Resatorvid,CLI-095）4umol/L调控脂毒性损伤的β细胞TLR4活性;或运用CRISPR-Cas9基因编辑技术沉默或过表达脂毒性损伤的β细胞TLR4基因;ELISA检测Ass1、磷酸化Ass1、精氨酸及瓜氨酸含量。2.3 TLR4与Ass1调控β细胞精氨酸生成的关系2.3.1 Ass1对脂毒性损伤的β细胞精氨酸生成的影响使用Ass1上游激酶蛋白激酶Cα（Protein Kinase C alpha,PKCα）激动剂佛波肉豆蔻醋酸（Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）1umol/L或Ass1特异性抑制剂DL-α-甲基天冬氨酸（DL-α-methyl aspartic acid,MDLA）1mmol/L调控脂毒性损伤的β细胞Ass1活性;或运用CRISPR-Cas9技术过表达脂毒性损伤的β细胞Ass1基因;Elisa检测各组细胞精氨酸含量。2.3.2 Ass1对TLR4调控β细胞精氨酸生成的影响。激活β细胞TLR4活性,同时调控Ass1的活性或过表达Ass1;ELISA检测β细胞精氨酸含量。2.4验证TLR4与Ass1的相互作用免疫荧光观察TLR4和Ass1的共定位情况,免疫共沉淀验证TLR4与Ass1蛋白的相互作用。3探讨Ass1及精氨酸对脂毒性损伤的β细胞的作用3.1 Ass1对脂毒性损伤的β细胞的作用建立脂毒性损伤的β细胞模型,调控Ass1的活性或表达。流式细胞技术检测细胞凋亡情况;Western blot检测TLR4、NF-κB、Ass1、PKCα蛋白表达。3.2精氨酸对脂毒性损伤的β细胞的作用10mmol/L的精氨酸干预脂毒性损伤的β细胞。流式细胞技术检测细胞凋亡情况;Western blot检测TLR4、NF-κB、Ass1、PKCα蛋白表达。结果:1 TLR4KO改善了高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛功能,并重新平衡了肥胖大鼠胰腺蛋白质组学的紊乱TLR4KO可降低肥胖大鼠的体重、空腹血糖和血清炎症因子（IL-1、IL-6）,改善葡萄糖耐量和胰岛素耐量以及胰岛素分泌功能,减轻肥胖大鼠胰岛炎性浸润和胰腺细胞凋亡,并改善胰腺α、β细胞的分布。TLR4KO降低了肥胖大鼠胰腺11个上调蛋白的表达、增加了7个下调蛋白的表达;基因本体论（GO）分析表明,差异蛋白参与的主要生物学过程为细胞大分子代谢过程、细胞组分组织或生物发生过程、细胞氮化物代谢过程等;涉及差异蛋白的通路主要有代谢通路、花生四烯酸代谢、细胞外基质受体相互作用、胰腺分泌等信号通路;蛋白互作网络（PPI）分析表明,丝氨酸-苏氨酸激酶（Stk39）和Ass1是差异蛋白中的节点蛋白,它们参与了炎症反应、外界刺激反应、防御反应、羧酸代谢过程和小分子代谢过程。TLR4KO可恢复高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰腺Ass1和精氨酸含量,降低正常大鼠和肥胖大鼠血清一氧化氮水平。2 TLR4介导了PA对β细胞Ass1及精氨酸生成的抑制作用,并促进了Ass1的磷酸化应用PA干预、激活或过表达TLR4均可降低β-tc6细胞Ass1和精氨酸含量,增加Ass1磷酸化水平;沉默或抑制TLR4可降低脂毒性损伤的β细胞Ass1和精氨酸含量的下降程度及Ass1的磷酸化水平;过表达Ass1可降低PA和LPS诱导的β细胞精氨酸含量的下降程度。TLR4与Ass1蛋白之间存在共定位和相互作用。3 Ass1可缓解脂毒性诱导的β细胞损伤抑制Ass1可促进β细胞凋亡及TLR4、NF-κB的蛋白表达,并损伤葡萄糖刺激的胰岛素分泌;过表达Ass1可降低PA诱导的β细胞凋亡程度,拮抗PA引起的TLR4、NF-κB蛋白的表达增加,并减轻PA诱导的胰岛素分泌功能障碍。精氨酸可拮抗PA诱导的TLR4和NF-κB蛋白表达的增加,并改善脂毒性损伤的β细胞胰岛素分泌功能,。结论:Ass1可通过拮抗TLR4-NF-κB通路缓解脂毒性造成的胰岛β细胞代谢性炎症损伤,这一作用可能和调控精氨酸的生成有关。