研究背景吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)是自身免疫介导的急性炎症性周围神经系统疾病,是在世界范围内引起急性迟缓性瘫痪最常见的疾病。临床呈急性或亚急性起病,主要临床表现是四肢软瘫、腱反射消失、颅神经麻痹,甚至呼吸衰竭。根据临床、电生理和病理特点,GBS谱系疾病可主要分为以下几种亚型:急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(acute inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathies,AIDP)、急性运动轴索性神经病(acute motor axonal neuropathy,AMAN)、急性运动感觉轴索性神经病(acute motor and sensory axonal neuropathy,AMSN),还包括 Miller-Fisher 综合征(MFS)、咽-颈-臂变异型(pharyngeal-cervical-brachial,PCB)、急性全自主神经病(acute panautonomic neuropathy),以及其他少见的变异型等。其中AIDP是最常见的亚型。实验性自身免疫性神经炎(Experimental autoimmune neuritis,EAN)与AIDP在免疫学及临床表现方面具有许多相似之处,是研究GBS发病机制及治疗方法的理想动物模型。AIDP和EAN的病理特点主要是周围神经系统中自身反应性T细胞和巨噬细胞的聚集以及周围神经系统脱髓鞘。AIDP和EAN的发病与Th1细胞(T helper 1 cells,Th1 cells)、Th2 细胞(T helper 2 cells,Th2 cells)、Th17 cells(T helper 17 cells,Th1 7 cells)、调节性 T 细胞(Regulatory T cells,Tregs)有关。AIDP 和 EAN 的发病与Th1细胞的扩增有关,Th1细胞主要能够分泌干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。Th1细胞因子能够趋化炎症细胞至PNS,促进其他细胞释放其他的炎症产物。Th2细胞因子包括白介素(interleukin 4,IL-40)和白介素 10(interleukin 10,IL-10),主要促进 B 细胞活化,抑制巨噬细胞活化。在EAN,Th1细胞因子主要介导对外周神经的炎性破坏作用,而Th2细胞因子主要与疾病恢复有关。另外,Th17细胞和其分泌的细胞因子白介素17(interleukin 17,IL-17)也可促进EAN的病情进展。Tregs是一种能够负调节免疫反应的T细胞亚型,在免疫耐受中起到重要作用。既往的研究证实Tregs能减少坐骨神经中炎症细胞浸润,对EAN具有保护作用。硫苷脂,也称3-O-硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇,主要分布于神经系统髓鞘、胰岛细胞和肾脏。一方面,硫苷脂在维持髓鞘功能及其稳定性方面起到重要作用。缺乏硫苷脂的小鼠会出现四肢颤抖,甚至四肢瘫痪。另一方面,有研究证实硫苷脂在免疫反应和自身免疫系统疾病中起到免疫调节的作用。迄今为止,已有大量研究证实硫苷脂能够抑制实验性自身免疫性脑炎、1型糖尿病、自身免疫性肝病等多种自身免疫性疾病。硫苷脂可被表面表达CD1d分子的抗原提呈细胞,如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞的亚型识别并提呈给Ⅱ型NKT细胞。硫苷脂介导的Ⅱ型NKT细胞活化能够抑制Ⅰ型NKT细胞、CD4+和CD8+T细胞。此外,硫苷脂免疫抑制的机制还包括:抑制Th17细胞分化、抑制树突状细胞(dendrite cells,DCs)以及抑制IFN-γ和IL-4的产生等。GBS的发病机制尚不确切,目前尚无有效的特异的治疗方法。目前主要的治疗方法是静脉滴注免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)和血浆置换(plasma exchange,PE)。但这两种治疗方法价格昂贵,且只能缓解部分病人的病情,仍有约10%病人遗留严重肢体残疾,甚至3%-5%的病人死亡。因此有必要继续探索治疗GBS的新药物。虽然已有研究证实硫苷脂对多种自身免疫疾病具有保护作用,但目前尚无硫苷脂用于治疗ENA的报道。研究目的探索硫苷脂对EAN的作用及其免疫学机制。研究方法1、EAN动物模型的诱导及症状评价利用牛马尾的周围神经髓鞘磷脂(bovine peripheral myelin,BPM)免疫Lewis大鼠制备动物模型。免疫后每天对大鼠进行称重及病情评分。评分标准:0分=未发病;1分=尾瘫;2分=后肢瘫;3分=四肢瘫;4分=濒死;5分=死亡。2、EAN动物模型的分组及治疗将ENA大鼠随机分为2组:对照组和治疗组。在免疫后的第5天、第8天和第1 1天,治疗组大鼠腹腔内注射140μg硫苷脂,对照组大鼠给予相同剂量的溶媒(0.5%聚山梨酯-20[Tween 20]和0.9%盐水)。免疫后第13天病情达到顶峰时处死大鼠。收集大鼠的淋巴结、坐骨神经用于随后的实验。3、流式细胞术分析通过研磨腹股沟淋巴结获得淋巴结单个核细胞悬液。分别应用CD4+IFN-γ+、CD4+IL4+、CD4+IL17A+、CD4+CD25+Foxp3+、CD3+CD161a+、和 CD3-CD161a+细胞来标记Th1、Th2、Th17、Tregs、NKT、NK细胞。分别用荧光素标记的CD3、CD4、CD161a和CD25抗体标记细胞膜表面分子。用CD4、CD25和Foxp3抗体标记调节性T细胞。用荧光素标记的CD4、CXCR5、ICOS抗体标记滤泡辅助性 T 细胞(follicular helper T cells,Tfh cells)。用荧光素标记的 IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17A抗体标记细胞内细胞因子。用流式细胞仪上机检测。4、细胞增殖实验先用竣基荧光素乙酰乙酸玻拍酰亚胺酯(carboxy-fluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)对淋巴结单个核细胞进行染色。然后在淋巴结细胞中加入ConA或者BPM,之后在37℃温箱中进行增殖培养,3天后收集细胞,用流式细胞仪进行检测。5、ELISA检测细胞增殖上清中的IL-17水平淋巴结单个核细胞在ConA或BPM的刺激下培养增殖3天后收集上清。应用大鼠IL-17 ELISA试剂盒检测IL-17水平。6、组织病理学和免疫组化检测坐骨神经中炎症细胞的漫润用4%多聚甲醛固定大鼠坐骨神经,然后进行脱水、石蜡包被,制作成石蜡切片。用HE染色检测坐骨神经中总的炎性细胞浸润情况。将石蜡切片脱蜡及抗原复活后,用大鼠CD68抗体标记巨噬细胞,免疫组化观察坐骨神经中巨噬细胞的浸润情况。7、统计学方法用SPSS 22和Prism 6软件分析实验数据。两组之间的数据差异应用t检验进行分析,实验结果用平均值±标准差来表示,p<0.05被认为具有统计学差异。研究结果1、硫苷脂延缓了 EAN发病及减轻了 ENA的严重程度对照组大鼠在免疫后第9天发病,而治疗组大鼠在免疫后第10天发病。两组大鼠病情均迅速进展,在免疫后第12天症状达到高峰。治疗组症状评分在免疫后第12天和第13天均低于对照组(p<0.05)。硫苷脂治疗组在免疫后第12天和第13天的临床评分分别为2.20±0.27和2.30±0.27,而对照组的评分分别为3.17±0.82 和 3.67±1.25。2、硫苷脂治疗抑制了淋巴结中Th1和Th17细胞的产生CD4+T细胞亚型间的不平衡参与EAN的发病。我们应用流式细胞仪分析了大鼠淋巴结中Th1、Th2、Th17以及Tregs的比例。实验结果显示硫苷脂治疗组CD4+细胞中Th1和Th17细胞比例明显低于对照组。同时,CD4+细胞中TNF-α阳性细胞也明显减少。但是,治疗组和对照组间Th2细胞和IL-10阳性细胞的比例无统计学差异。两组间Tregs细胞比例也无明显差异。因此硫苷脂分别上调了Tregs与Th1和Th17细胞的比例。3、硫苷脂治疗抑制了 Tfh细胞和抗原提呈细胞有研究发现B细胞参与EAN的发病。Tfh细胞是协助B细胞增殖和分化的主要T细胞亚型。因此我们研究了硫苷脂对Tfh细胞的影响。研究结果发现硫苷脂治疗组大鼠淋巴结中的Tfh细胞的比例明显低于对照组。既往的研究显示硫苷脂通过抑制树突状细胞可缓解EAE,因此我们研究了硫苷脂对抗原提呈细胞的影响。流式细胞术检测显示治疗组CD80和CD86阳性细胞的比例较对照组明显下降,MHCⅡ阳性细胞的比例也有下降趋势,但无统计学意义。4、硫苷脂抑制了 NK和NKT细胞NK和NKT细胞与自身免疫性疾病的发病有关,硫苷脂通过激活Ⅱ型NKT细胞,抑制Ⅰ型NKT细胞能够缓解多种自身免疫性疾病。因此,我们研究了硫苷脂治疗对NK细胞和NKT细胞的影响。结果发现硫苷脂治疗组大鼠的淋巴结中NK和NKT细胞的比例明显低于对照组大鼠。但是未发现两组大鼠NK和NKT细胞分泌的IFN-γ水平有明显差别。5、体外实验证实硫苷脂抑制了 T细胞增殖和IL-17分泌为评价硫苷脂对淋巴细胞增殖的影响,治疗组和对照组的淋巴细胞经CFSE染色后,分别在ConA或BPM存在的条件下在温箱中培养了 72小时。实验结果显示硫苷脂抑制了 Con A或BPM刺激下的CD4+T细胞增殖。并且ELISA结果显示硫苷脂降低了 Con A或BPM刺激下的单核细胞上清液中IL-17水平。6、硫苷脂治疗没有改变周围神经中炎症细胞的浸润为检测硫苷脂对EAN大鼠周围神经中炎症细胞浸润的影响,我们采集了两组大鼠的坐骨神经,并分别进行了 HE染色和免疫组化。HE染色结果显示对照组和硫苷脂治疗组坐骨神经均有大量的炎症细胞浸润,但两组差别无统计学意义。两组间坐骨神经中CD68抗体标记的巨噬细胞浸润也无明显差异。结论硫苷脂可延缓ENA的发病及减轻EAN的病情。其机制与抑制Th1和Th17细胞以及抑制Tfh细胞和抗原提呈细胞有关。由于人类也具有Ⅱ型NKT细胞,硫苷脂因能激活Ⅱ型NKT细胞,有潜能成为治疗GBS的新药。