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第一部分遗传性牙釉质发育不全相关基因Fam83h突变的鉴定与分析[目的]对五个患有遗传性牙釉质发育不全的家族进行Fam83h测序分析，以探讨其发病是否与Fam83h突变有关。[方法]对五个家族所有成员取外周血2ml，用QIAGEN公司的QIAamp? DNABlood Maxi Kit提取基因组DNA。根据人Fam83h基因组DNA全长序列设计7对引物，首先PCR扩增出五个家族先证者的编码区Fam83h DNA，然后对所有PCR产物进行测序，对比Genebank的人Fam83h源序列，寻找Fam83h突变位点。若先证者的某Fam83h位点存在突变，再扩增该家族其他所有招募成员的Fam83h编码序列并测序，若所有患者在此位点均有相同变异，而未受影响成员在此位点无变异，则可确认该位点变异为致病突变。[结果]检测的五个AI家族中，有两个家族鉴定出两个新的致病性的Fam83h突变。家族1为西班牙人，按照标准命名法，Fam83h变异位点为：Fam83h c．1330C＞T，p．Q444X，位于外显子5，突变类型为过早引入终止密码子，C末端氨基酸缺失735个；家族2为高加索人，Fam83h突变位于Fam83h c．1192C＞T，p．Q398X，位于外显子5，突变类型也为过早引入终止密码子，C末端氨基酸缺失781个。结合遗传方式及表型分析，此两个家族均为常染色体显性遗传钙化不全型AI（ADHCAI）。另外三个招募的AI家族未筛选到Fam83h变异。[结论]Fam83h cDNA1330位点和1192位点C＞T的突变会导致ADHCAI。第二部分Fam83h亚细胞定位的研究实验一Fam83h真核表达载体的构建[目的]构建融合绿色荧光的Fam83h真核表达载体。[方法]从日本Yokohama公司购买含有小鼠Fam83h cDNA的质粒pBluescriptⅡKS+-Fam83h cDNA，设计Fam83h引物，引入SalⅠ和BglⅡ酶切位点，PCR扩增出小鼠Fam83h cDNA全长编码区后，连入PCR2．1-TOPO T载体，转化大肠杆菌TOP10，铺板，扩增，提取PCR2．1-TOPO-Fam83h质粒，SalⅠ和BglⅡ双酶切初步鉴定正确克隆，将酶切正确的克隆测序。SalⅠ和BglⅡ双酶切测序正确的克隆从而释放出Fam83h，连入BamHⅠ和SalⅠ双酶切过的phrGFP-C绿色荧光表达载体，转化大肠杆菌TOP10，铺板，扩增，提取phrGFP-C-Fam83h质粒，SalⅠ和NdeⅠ双酶切初步鉴定正确克隆，将酶切正确的克隆再次测序确认。[结果]成功扩增出3651bp的小鼠Fam83h编码区序列，PCR2．1-TOPO-Fam83h质粒测序结果显示扩增出的Fam83h序列和genebank收录的Fam83h源序列完全一致。phrGFP-C-Fam83h质粒测序结果显示Fam83h序列被连入到phrGFP-C正确区域。[结论]成功构建phrGFP-C-Fam83h荧光真核表达载体，为实验二和实验三打下基础。实验二检测Fam83h是否为细胞内蛋白[目的]体外检测Fam83h是否为胞内蛋白或为分泌性蛋白。[方法]复苏HEK293细胞，待细胞生长状态良好时，接种入腔室载玻片进行培养，接种密度为2-6×105个细胞/cm2。24小时后，将实验一构建的phrGFP-C-Fam83h质粒，与脂质体Lipofectamine 2000按1μg：1μl的比例转染入HEK293细胞，放入培养箱继续培养，6小时后更换培养液。24-72小时后倒置显微镜下观察细胞形态及存活率，4％多聚甲醛固定细胞，分别用DiI和DAPI进行胞膜和胞核染色，封片，在荧光显微镜下观察来自Fam83h的绿色荧光是否位于细胞内并拍照。[结果]在HEK293细胞中，来自Fam83h的绿色荧光总是位于染成红色的胞膜之内，这充分表明Fam83h是一个胞内蛋白，而不是被分泌性到胞外。而且，Fam83h的绿色荧光信号很少和胞核重叠，绝大多数是位于胞核周围，特别是高尔基体常在的胞核前沿内陷处，排除拍照的角度问题，我们推测Fam83h很可能位于胞核周围的细胞器，特别是高尔基体。[结论] Fam83h是一个非分泌性蛋白，它位于细胞内，但不在胞核内。Fam83h很可能位于胞核周围的细胞器，特别是与高尔基体密切相关。实验三检测Fam83h的亚细胞定位[目的]体外探讨Fam83h亚细胞定位与高尔基体的关系。[方法]复苏HEK293细胞，待细胞生长状态良好时，接种入腔室载玻片进行培养，接种密度为2-6×105个细胞/cm2。24小时后，将实验一构建的phrGFP-C-Fam83h质粒，与脂质体Lipofectamine 2000按1μg：1μl的比例转染入HEK293细胞，放入培养箱继续培养，6小时后更换培养液。24-72小时后倒置显微镜下观察细胞形态及存活率，4％多聚甲醛固定细胞，并用DAPI进行胞核染色及BODIPY进行高尔基体染色，封片，在荧光显微镜下观察Fam83h绿色荧光信号与高尔基体的关系并拍照。[结果]在HEK293细胞中，来自Fam83h的绿色荧光总是位于高尔基体的红色荧光之内，且面积总是小于红色荧光，这充分表明Fam83h是位于高尔基体之内。并且，Fam83h绿色荧光所在位置的高尔基体红色荧光明显变淡，甚至无红色荧光，表明Fam83h蛋白可能定位于高尔基体膜表面。[结论] Fam83h蛋白在细胞内定位与高尔基体密切相关，可能位于高尔基体膜表面。