论文部分内容阅读
第一部分：我们观察了X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)反义寡核苷酸(ASODNs)对急性早幼粒白血病细胞系HL-60细胞的增殖、凋亡及对化疗药物敏感性的影响。将人工合成的XIAP全硫代反义寡核苷酸，以脂质体．反义寡核苷酸复合物的形式转染HL-60细胞。应用CCK-8实验检测反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及对柔红霉素敏感性的影响，RT-PCR和Westernblot技术检测HL-60细胞XIAP的mRNA和蛋白的变化，JC．1检测细胞线粒体膜电位变化，流式细胞仪AnnexinV／PI双染色法检测细胞的凋亡率，比色法检测细胞内Caspase-3活性改变。结果表明：(1)XIAPASODNs能够抑制HL-60细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性；(2)XIAPASODNs使HL-60细胞的mRNA和蛋白表达均明显下调，mRNA较对照组减少了77．78％，蛋白较对照组减少了73．33％；(3)XIAPASODNs使HL-60细胞线粒体膜电位下降，细胞浆荧光由红色转变为绿色；(4)XIAPASODNs组HL-60细胞的凋亡率为52．73％，错义链组为11．99％，两组相比，差异具有显著性(P<0．05)；(5)XIAPASODNs使HL-60细胞Caspase-3活性明显增高，与对照组比较具有统计学意义(0．961~0．022vs0．055~0．008,P<0．05)；(6)XIAPASODNs使HL-60细胞对柔红霉素的敏感性增加，900nmol／LXIAP反义寡核苷酸与0．5ug／ml柔红霉素联合作用72小时，对HL-60细胞的杀伤率为86．57％，高于XIAP反义寡核苷酸组的56．59％(P<0．05)和柔红霉素组的63．05％(P<0．05)。结果提示XIAP可能参与了白血病细胞的增殖和凋亡机制，通过下调XIAP有可能为抑制白血病细胞增殖、促进凋亡和增加对化疗药物的敏感性提供新的途径。
第二部分：我们探讨了XIAP在纤维连接蛋白(FN)黏附介导的HL-60细胞耐药中的作用，观察XIAP反义寡核苷酸对其逆转作用。我们用FN包被培养板，同时以牛血清白蛋白(BSA)包被培养板作为对照。通过CCK-8实验检测FN黏附对柔红霉素敏感性的影响，流式细胞仪检测FN黏附后HL-60细胞内DNR浓度的变化，RT-PCR、Westernblot分别检测FN黏附对HL-60细胞XIAP、BCL-2、MRP和MDRl的mRNA和蛋白表达的影响。并将人工合成的XIAP全硫代反义寡核苷酸，通过脂质体途径转染与FN黏附培养的HL-60细胞，CCK-8实验计算细胞杀伤率，根据DNR浓度对数与细胞杀伤率之间的线性回归方程计算IC50值，RT-PCR、Westernblot检测XIAP的mRNA和蛋白变化。结果表明，HL-60细胞与FN黏附后，对柔红霉素的敏感性下降，FN组IC50为0．526umol／L，明显高于BSA组(0．132umol／L)和悬浮培养组(0．123umol／L)(P<0．05)：RT-PCR和Westemblot结果显示，FN黏附组HL-60细胞的XIAP在mRNA和蛋白水平均较BSA组和悬浮培养组明显上调(P<0．05)，而BCL-2、MRP和MDRl的表达与后两组无明显差别(P>0．05)；流式细胞仪检测显示，FN黏附组HL-60细胞内的DNR浓度与BSA黏附组和悬浮对照组比较无统计学差异(P>0．05)。XIAP反义寡核苷酸使FN黏附介导耐药的HL-60细胞XIAP的mRNA和蛋白表达均明显下调，对柔红霉素的敏感性增加。上述结果提示，XIAP可能参与了FN黏附介导的HL-60细胞耐药的发生，应用XIAP反义寡核苷酸能够逆转FN黏附介导的HL-60细胞的耐药。
第三部分：我们探讨了HL一60／ADR细胞的耐药机制，比较XIAP和MRP反义寡核苷酸单独应用及二者联合应用对HL一60/ADR细胞耐药的逆转作用。应用RT一PCR和Westernblot技术检测并比较HL一60细胞和HL一60／ADR细胞的BCL一2、XIAP、MDRl、MRP在mRNA和蛋白水平表达的差异。将XIAP和MRP全硫代反义寡核苷酸，以脂质体一反义寡核苷酸复合物的形式，单独或联合转染乩一60／ADR细胞，应用CCK一8实验测定反义寡核苷酸对DNR敏感性影响；RT-PCR和Westernblot检测反义寡核苷酸对XIAP、MRP的mRNA和蛋白表达的影响。结果显示，乩一60/ADR·细胞的MRP和XIAP的表达均明显高于HL一60细胞。XIAP反义寡核苷酸和MRP反义寡核苷酸单独应用能够分别下调XIAP和MRP的表达，增加对柔红霉素的敏感性；二者联合应用与XIAP反义寡核苷酸单独应用比较，并不能增强对XIAP表达的抑制作用(P>0．05)，但使HL-60／ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显增加(P<0．05)；二者联合应用与MRP反义寡核苷酸单独应用比较，并不能提高HL-60／ADR细胞内DNR浓度及增强对MRP表达的抑制作用，却使HL-60／ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显增加(P<0．05)。上述结果提示，XIAP和MRP都可能参与了HL一60/ADR细胞的耐药机制，联合应用针对二者的反义寡核苷酸能更大程度逆转HL一60/ADR细胞的耐药。