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目的:近年,2型糖尿病(type2 diabetesmellitus,T2DM)、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病率逐年增高,而2型糖尿病患者中非酒精性脂肪性肝病的发病率达到50％以上,肥胖、胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)、糖脂代谢紊乱是2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病发生的主要原因,解偶联蛋白2(uncoupling protein-2,UCP2)是线粒体内膜上调节质子转运的阴离子载体蛋白,与胰岛素抵抗、氧化应激、能量稳态及糖脂代谢等密切相关。本实验通过构建2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病及2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的大鼠疾病模型,研究多种炎性因子及解偶联蛋白1(uncoupling protein-1,UCP1)、UCP2在上述疾病模型中表达的变化,探讨UCP2在T2DM并发NAFLD的发生中的作用,为进一步研究2型糖尿病并发非酒精性脂肪性肝病的发病机制,临床治疗肥胖、糖尿病、脂肪肝寻求新靶点。 方法: 1.建立动物模型:60只雄性健康SD大鼠随机分为对照组(NC组)、2型糖尿病组(T2DM组)、非酒精性脂肪肝病组(NAFLD组)、2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病组(T2DMN组)。2型糖尿病组予高脂饮食喂养,非酒精性脂肪肝病组与2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病组予改良高脂饮食喂养,8周后2型糖尿病组与2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病组腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),对照组与非酒精性脂肪肝组腹腔注射等量生理盐水。 2.监测大鼠体重,实验结束时,测定空腹血糖、随机血糖,肝脏取材,称量肝脏的湿重,计算肝指数、胰岛素敏感指数、胰岛素抵抗指数,行光镜、电镜观察肝脏病理组织学改变。确定各组是否造模成功。 3.全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、高敏C反应蛋白(high sensitive C reactive protein,hs-CRP)、甘油三酯(triglyceride,TG)以及总胆固醇(total cholesterol,TC)。双抗体放射免疫分析法测定血清空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)。酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清脂联素(adiponectin,APN)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)水平的变化。应用免疫组化检测肝脏组织中 UCP1和 UCP2蛋白表达,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction,RT-PCR)检测UCP1和UCP2的mRNA表达,免疫印迹法(Western blotting,WB)法检测肝脏组织中UCP1和UCP2蛋白表达。 结果: 1.生长情况:(1)各组大鼠的体重均呈现增长趋势。(2)模型组与NC组对比体重增长明显,4周与8周时有明显差异(P<0.05)。(3)NAFLD组与T2DMN组间无明显差异,NAFLD组、T2DMN组与T2DM组4周时无差异,8周时有明显差异(P<0.05)。 2.大鼠的肝脏形态学变化:NAFLD组、T2DMN组大鼠肝脏的形态、大小和NC组、T2DM组比较有明显改变。模型组大鼠光镜及电镜的超微结构变化较NC组明显。各组肝脏脂肪变性程度存在明显差异(P<0.05)。 3.血糖、胰岛素抵抗指数、胰岛素敏感指数:(1)空腹血糖、随机血糖: NC组、NAFLD组与T2DM组、T2DMN组比较有明显差异(P<0.05),NC组与NAFLD组, T2DM组与 T2DMN组比较无明显差异。(2)胰岛素抵抗指数、胰岛素敏感指数:NC组、NAFLD组与T2DM组、T2DMN组比较有明显差异(P<0.05),NC组与NAFLD组,T2DM组与T2DMN组比较有明显差异。 4.炎性因子检测:模型组与 NC组对比,模型组血清 APN含量均降低,模型组之间相比较,T2DM组、NAFLD组、T2DMN组依次降低,有明显差异(P<0.05)。模型组与NC组对比,FFA及hs-CRP含量均显著升高,模型组之间相比较,T2DM组、NAFLD组、T2DMN组依次升高,有明显差异(P<0.05)。 5.免疫组化及western blot检测:(1)UCP1蛋白在NC组、T2DM组中呈低表达,在NAFLD组及T2DMN组中呈高表达,且T2DMN组表达阳性程度与NAFLD组比较有明显差异(P<0.05)(2)UCP2蛋白在NC组中呈低表达,在模型组中呈高表达,且表达阳性程度以T2DM组、NAFLD组、T2DMN组依次升高,各组之间比较有明显差异(P<0.05)。 6.RT-PCR检测:(1)UCP1mRNA在NC组、T2DM组中呈低表达,在NAFLD组及T2DMN组中呈高表达,且T2DMN组表达阳性程度与NAFLD组比较有明显差异(P<0.05)。(2)UCP2mRNA在 NC组中呈低表达,在模型组中呈高表达,且表达阳性程度以T2DM组、NAFLD组、T2DMN组依次升高,各组之间比较有明显差异(P<0.05)。 7.肝脏脂肪变性程度与UCPs的相关性:通过相关性分析,肝脏脂肪变性程度与UCPs表达存在相关性(P<0.05)。 8.相关因子与UCPs的相关性:通过相关性分析,APN与UCPs表达存在负相关性(P<0.05),FFA、hs-CRP及胰岛素抵抗指数表达存在正相关性(P<0.05)。 结论: 1.成功建立了2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病模型。 2.在2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的发生及发展过程中,血清APN、FFA、hs-CRP的水平可以反映其进展。 3.UCPs蛋白参与了2型糖尿病的非酒精性脂肪性肝病发生发展过程。 4.通过干预UCPs蛋白表达,可能延缓病变进展。