研究背景：PRKAG2心脏综合征是一种由于编码单磷酸腺苷激活蛋白激酶γ2亚基的PRKAG2基因遗传性缺陷导致的罕见的常染色体显性遗传病，它的典型表现为：心室预激，进展性传导系统疾病和心脏肥大。2001年Gollob等首次报道PRKAG2基因突变与家族性预激综合征、传导系统疾病和心脏肥大有关，此后陆续有PRKAG2基因突变与相似家系相关的报道。迄今为止，国内外至少在20个家族性传导系统异常伴心室预激及心肌肥厚家系中发现11种与该疾病发病有关的PRKAG2基因突变。我科张静博士2007年报道了一个中国人大家系，家系的临床表型符合国外家系报道的共性，对家系成员进行PRKAG2基因测序，在外显子3上发现了一个新的错义突变即第100位甘氨酸突变为丝氨酸（G100S），这个突变是国内外从来没有报道过的，该突变可能导致中国人PRKAG2心脏综合征的发生。目前研究认为，PRKAG2心脏综合征是一种由于AMPK活性紊乱导致糖原沉积的心脏代谢性疾病。国外报道的PRKAG2基因突变都出现在胱硫醚β-合成酶（CBS）区域，突变引起Bateman结构域结合AMP能力下降从而导致AMPK活性改变。我们发现的G100S突变，不在国外报道的突变位点之列，相反，既往国外报道的这些位点测序完全正常，该突变并不位于CBS区域，其引起家系患者心肌肥厚的致病机制还不清楚。为了验证G100S突变在中国人PRKAG2心脏综合征家系中的致病作用，我们通过在斑马鱼中过表达PRKAG2突变基因，研究G100S突变对基因表达、AMPK活性、糖原代谢及心脏肥大的影响，考察G100S新突变的功能，在整体动物水平证实该突变的功能意义，同时加深对PRKAG2基因非CBS区域的功能了解，初步阐明G100S新突变引起中国人PRKAG2心脏综合征的致病机制。目的:研究基因PRKAG2G100S新突变的功能，探讨该突变在中国人家族性传导系统异常伴心室预激及心肌肥厚家系中的发病机制。方法:（1）斑马鱼心肌特异性启动子vmhc的克隆及功能鉴定：从斑马鱼组织中抽提斑马鱼基因组DNA，应用PCR技术克隆得到斑马鱼心肌特异性肌球蛋白重链（ventricular myosin heavy chain，vmhc）启动子基因功能片段序列，构建启动子vmhc驱动的增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）表达载体，应用PCR技术克隆得到vmhc驱动的增强型绿色荧光蛋白基因片段，通过显微注射技术将外源基因导入斑马鱼受精卵，观察其在斑马鱼心肌中的表达特性及特异性。（2）vmhc驱动的人PRKAG2野生型及突变型基因表达载体的构建：应用Trizol法抽提健康人全血mRNA，RT-PCR克隆人野生型PRKAG2基因，继而构建重组载体pEGFP-PRKAG2；通过PCR定点突变的方法构建人突变型PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S和pEGFP-R302Q，应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-vmhc-WT、pEGFP-vmhc-G100S和pEGFP-vmhc-R302Q，最后应用搭桥PCR方法引入HA标签。（3）人PRKAG2野生型及突变型基因在斑马鱼中的实验研究：通过PCR扩增得到vmhc-WT/G100S/R302Q-HA基因片段，应用显微注射技术将上述外源基因片段导入斑马鱼受精卵，并以R302Q为阳性对照，野生型WT为阴性对照，未显微注射外源基因的斑马鱼胚胎为空白对照，分别进行real-timePCR验证PRKAG2基因表达，Western Blot验证PRKAG2蛋白表达，斑马鱼心脏组织学检查，PAS染色检测心肌糖原含量，比色法定量检测AMPK活性。结果：（1）正确克隆了vmhc启动子基因功能片段序列（1952bp），通过显微注射技术将包含vmhc启动子序列，EGFP序列及3UTR序列的基因片段导入斑马鱼受精卵，荧光显微镜下在斑马鱼心脏区域观察到绿色荧光。通过RT-PCR扩增EGFP基因及western-blot检测EGFP蛋白，验证了外源EGFP基因及蛋白在斑马鱼中的成功表达。（2）正确克隆了人野生型PRKAG2基因，成功构建了重组载体HA-vmhc-WT、HA-vmhc-G100S和HA-vmhc-R302Q。（3）应用显微注射技术将vmhc-WT/G100S/R302Q-HA基因片段分别导入斑马鱼受精卵，通过对各组斑马鱼的Real-time PCR检测，发现注射有外源基因片段的斑马鱼有PRKAG2基因的表达，而未注射有外源基因片段的对照组斑马鱼没有PRKAG2基因的表达，表明vmhc启动子驱动WT、GS、RQ基因成功在斑马鱼中表达。进一步通过分析PRKAG2基因与内参actin的CT值，提示三个外源基因表达水平的高低为：WT>GS>RQ。通过对各组斑马鱼HA的表达量的Western Blot检测，发现未注射基因片段的对照组无HA蛋白表达，而注射有外源基因片段的各实验组均有HA蛋白表达，RQ组的蛋白表达最弱，GS组稍弱于WT组，说明vmhc启动子可以驱动WT、GS、RQ三个基因型在斑马鱼中的蛋白表达，但G100S突变与R302Q突变阻碍了PRKAG2蛋白在斑马鱼中的正常表达，G100S突变的阻碍作用要弱于R302Q突变。通过比较各组斑马鱼心脏连续切片中最厚处心壁厚度，结果显示：GS组（14.71±1.97μm）心壁厚度显著大于control组（11.74±1.86μm）（P=0.021）和WT组（11.81±2.09μm）（P=0.024），RQ组（17.94±2.30μm）心壁厚度显著大于GS组（P=0.014），提示G100S突变和R302Q突变会引起斑马鱼心脏肥厚。通过对各组斑马鱼心脏切片PAS法染色，发现WT、GS、RQ组斑马鱼心壁糖原沉积较control组增多。通过检查各组斑马鱼组织AMPK活性，结果显示：GS组（0.046213±0.001501μmolNADH/min/mg）和RQ组（0.022037±0.001228μmolNADH/min/mg） AMPK活性显著低于control组（0.06257±0.000935μmolNADH/min/mg）（P=0.000）和WT组（0.084877±0.001879μmolNADH/min/mg（）P=0.000），GS组AMPK活性显著高于RQ组（P=0.000），WT组AMPK活性显著高于control组（P=0.000）。结论：（1）PRKAG2G100S突变导致了PRKAG2基因功能发生改变，验证了G100S突变是中国人PRKAG2心脏综合征家系的发病原因，证实了G100S突变导致AMPK活性降低及糖原累积是中国人PRKAG2心脏综合征家系的发病机制。（2）位于PRKAG2基因非CBS区域的G100S突变与CBS区的R302Q突变的基因生物学功能相似，说明G100S和R302Q对AMPK活性调节的机制可能是一致的，G100S突变也可能是作用于Bateman结构域，损害了Bateman结构域结合AMP的能力，但位于非CBS区的G100S突变所导致的基因生物学效应弱于位于CBS区的突变，非CBS区对PRKAG2基因功能的影响可能弱于CBS区。