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大豆与根瘤菌共生固氮可为其提供一生所需氮素23～65%,挖掘结瘤固氮相关基因并明确其生物学功能及作用机制,对高固氮新种质创制及新品种培育意义重大。鉴于此,本研究通过分析大豆不同发育时期根瘤蛋白质组,筛选结瘤固氮相关基因,采用qRT-PCR、启动子GUS染色和原位杂交等技术分析基因时空表达;利用超表达、RNAi技术研究基因功能,通过CRISPR/Cas9技术构建转基因大豆突变体,明确基因在结瘤固氮中的生物学功能;采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术鉴定和筛选互作蛋白,利用Pull-down、BiFC、Co-IP和Y2H方法验证互作蛋白,并结合互作蛋白功能分析,解析基因在结瘤固氮中的调控机制。主要结果如下:1.通过不同发育时期根瘤蛋白质组筛选出结瘤固氮相关小热激蛋白GmHSP17.9和GmHSP17.1。大豆品种Williams82不同发育时期根瘤蛋白质组分析发现,随着根瘤生长发育,参与调控根瘤发育蛋白数量逐渐增多,与接种前相比,接种10 d根瘤存在665个差异表达蛋白,17 d根瘤有1065个差异蛋白,28 d成熟根瘤有1279个差异蛋白;其中,小热激蛋白GmHSP17.9和GmHSP17.1在17 d和28 d根瘤高效表达,且以28 d成熟根瘤表达量最高。2.通过转基因大豆复合植株明确了 GmHSP17.9在结瘤固氮中的生物学功能。GmHSP17.9位于4号染色体,全长878 bp,含1个外显子,无内含子,CDS序列477 bp,编码158个氨基酸;GmHSP17.9位于细胞质,属于CⅡ亚家族;qRT-PCR结合启动子GUS染色表明,GmHSP17.9在根瘤优势表达,且在28 d成熟根瘤表达量最高;GmHSP17.9启动子GUS染色及原位杂交表明,该基因在根瘤侵染区特异表达;转基因大豆复合植株证实,超表达GmHSP17.9可显著增强结瘤固氮能力,RNAi抑制该基因表达则显著降低大豆结瘤固氮。3.通过CRISPR/Cas9转基因大豆突变体进一步验证了GmHSP17.9在结瘤固氮中的重要功能。经CRISPR/Cas9技术获得两个GmHSP17.9突变体株系hsp17.9-1和hsp17.9-2,其中hsp17.9-1株系Target 1有1个碱基插入,Target 2有5个碱基缺失,hsp17.9-2株系Target 1无变化,Target 2含有98个碱基插入和6个碱基缺失,导致翻译移码与提前终止;分析发现,hsp17.9根瘤生长发育受到明显抑制,两个突变株系固氮酶活性分别较野生型显著降低29.2%和37.5%,植株生长发育亦受抑制,单株产量分别显著降低41.4%和46.0%;透射电子显微镜观察hsp17.9根瘤超微结构发现,根瘤共生体结构严重受损,且类菌体PHB含量显著降低。4.通过互作蛋白分析明确了 GmHSP17.9作为蔗糖合酶GmNOD100分子伴侣调控大豆结瘤固氮。体外MDH热凝聚及DTT诱导胰岛素凝聚证实GmHSP17.9具有分子伴侣活性,Native-PAGE与拟南芥原生质体BiFC证实GmHSP17.9可形成多聚体;Pull-down结合LC-MS/MS发现,蔗糖合酶GmNOD100是GmHSP17.9潜在互作蛋白,Y2H、BiFC、Co-IP和Pull-down证实其互作:进一步分析发现,GmNOD100在根瘤中优势表达,且28 d根瘤表达量最高,表达部位主要集中在根瘤侵染区;亚细胞定位显示GmNOD100属于胞质蛋白;转基因复合植株证实,超表达GmNOD100可显著提高结瘤固氮能力,且蔗糖合酶活性、UDP-葡萄糖含量、乙酰辅酶A含量以及SDH活性显著增加,而抑制GmNOD100表达则出现相反表型;体外试验证实GmHSP17.9作为分子伴侣保护GmNOD100蔗糖合酶活性,但对其表达量无显著影响;并且,hsp17.9突变体根瘤蔗糖合酶活性显著降低14.3%和20.9%,产物UDP-葡萄糖和乙酰辅酶A含量及SDH活性亦显著下降。5.转基因大豆复合植株明确了GmHSP17.1在结瘤固氮中的生物学功能。GmHSP17.1位于6号染色体,含1个外显子,无内含子,编码150个氨基酸组成的CI亚族胞质小热激蛋白;qRT-PCR、启动子GUS染色表明,GmHSP17.1在根瘤优势表达,且在28 d成熟根瘤表达量最高;转GmHSP17.1大豆复合植株证实,超表达GmHSP17.1可显著增强结瘤固氮能力,并改善地上部植株长势,提高植株氮含量;GmHSP17.1的RNAi复合植株结瘤固氮能力与植株地上部长势显著抑制,植株氮含量亦显著降低。6.明确了 GmHSP17.1作为过氧化物酶GmRIP1分子伴侣调控大豆结瘤固氮。体外MDH热凝聚及DTT诱导胰岛素凝聚反应证实GmHSP17.1具有分子伴侣活性;Pull-down结合LC-MS/MS发现,过氧化物酶GmRIP1是GmHSP17.1潜在互作蛋白,Y2H、BiFC和Pull-down进一步证实其互作;GmRIP1是一种胞质蛋白,在根瘤高效表达并随根瘤发育表达量逐渐升高,在28 d成熟根瘤表达量达到峰值;根瘤POD活性与GmRIP1表达量趋势一致;超表达GmHSP17.1根瘤POD活性提高23.2%,ROS含量降低33.1%,而RNAi根瘤POD活性降低46.3%,ROS含量上升17.1%。综上,本研究通过不同发育时期大豆根瘤差异蛋白筛选,获得2个在根瘤高效表达的小热激蛋白GmHSP17.9和GmHSP17.1;通过转基因大豆证实GmHSP17.9和GmHSP17.1参与结瘤固氮;且GmHSP17.9通过与GmNOD100互作调节蔗糖合酶活性,影响根瘤形成和发育过程中的能量供应,进而调控结瘤固氮;GmHSP17.1则作为过氧化物酶GmRIP1的分子伴侣调控根瘤POD活性,影响ROS含量,进而调控大豆结瘤固氮。