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生物体衰老是一个包含不同器官和系统的、发生一系列特定变化的复杂过程。皮肤衰老是机体衰老最直接的表现,本质和基础是皮肤细胞的衰老,其不仅受控于遗传基因的调节,也受控于表观遗传的调控,后者是衰老发生的重要机制,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及microRNA (miRNA)调控等。miRNA-217是一种已知高表达于人脐静脉内皮细胞及人冠状动脉内皮细胞中的miRNA,已被证实其在胰腺导管腺癌中能通过靶向调控KRAS起到肿瘤抑制因子的作用,还可靶向调节Runx2,从而影响成骨细胞成熟。在衰老机制的研究中,已有报道显示,miR-217在衰老的血管内皮细胞中表达上调,并可通过抑制长寿基因Sirt1的表达导致血管内皮细胞的衰老。然而,至目前为止,miR-217对于皮肤衰老的作用研究还不清楚。本课题组前期通过miRNA芯片发现传代衰老组与年青组人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts, HSF)比较,miR-217的表达量明显增加。因此,我们推测miR-217可能在HSF衰老中起到了重要作用。本研究通过三个部分证实miR-217在HSF衰老中的作用机制。第一部分：检测比较年青组与衰老组HSF中miR-217的表达。第二部分：研究miR-217在HSF衰老过程中的作用。通过在年青组HSF中过表达miR-217并检测细胞衰老的表型及相关衰老蛋白的表达,以探讨miR-217在细胞衰老中的作用。第三部分：研究miR-217调控HSF衰老的机制：(1)通过生物信息学预测,发现miR-217可能直接靶向DNA甲基化转移酶1(DNMT1),利用双荧光素酶报告基因系统证明两者的直接靶向关系；(2)在HSF中,检测miR-217对DNMT1表达量的调节,及其通过DNMT1对细胞衰老调节的机制。通过以上研究揭示miR-217能够通过下调DNMT1来促进HSF的衰老,为皮肤衰老的研究和治疗领域提供新的方向。第一部分年青组与衰老组人皮肤成纤维细胞中miR-217的表达目的：检测自然衰老与传代衰老HSF中miR-217的表达水平。方法：收取少年组(<10岁)、中年组(30～50岁)与老年组(>60岁)的正常人避光部位皮肤,原代培养HSF,并将少年组HSF进行传代(年青组：P3-5,衰老组：P20-25),采用Real-time PCR方法检测miR-217的表达量。结果：和少年组细胞比较,中年组、老年组HSF中的miR-217表达量明显升高(中年组：P<0.05,老年组：P<0.01),其中老年组较中年组细胞中miR-217的表达量也显著升高(P<0.01)。和年青组细胞比较,传代衰老组细胞的miR-217的表达量亦明显升高(P<0.01)。结论：自然衰老与传代衰老的HSF中miR-217的表达明显上升。第二部分miRNA-217对人皮肤成纤维细胞衰老的作用目的：研究miR-217在HSF衰老过程中的作用。方法：在年青组HSF中,通过稳定转染hsa-miR-217的慢病毒和阴性对照慢病毒,48小时后,采用Real-time PCR方法检测miR-217的表达量,MTT法检测HSF细胞增殖能力,衰老β-半乳糖苷酶染色法检测HSF的衰老相关染色率,western blot法检测衰老相关蛋白P53、P21、sirt1等的改变。结果：转染hsa-miR-217的慢病毒后,HSF中的miR-217表达量显著上调(P<0.01),细胞增殖能力明显下调(P<0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明显上升(P<0.01),衰老相关蛋白P53、P21的表达量上升、sirt1表达量下降(P<0.05)。结论：过表达miR-217可明显促进HSF的衰老,miR-217在HSF的衰老过程中起到重要作用。第三部分miRNA-217直接调控HSF中DNMT1的表达及机制目的：研究miR-217在HSF衰老过程中的调控机制。方法：通过MICRORNA.ORG网站预测DNMT1是否为hsa-miR-217可能的直接靶向基因,并构建DNMT1的3’UTR区域的野生型与突变型的荧光素酶报告基因质粒,在293T细胞中,分别转染野生型与突变性DNMT1-3’UTR质粒,4小时后将miR-217化学模拟物(mimics)转染细胞,48小时后溶解细胞,荧光素酶检测系统分析荧光强度。构建含DNMT1shRNA序列的慢病毒载体,通过在年青组HSF中抑制DNMT1的表达量来检测HSF的衰老表型。利用第二部分中稳定转染的年青组HSF,提取细胞总蛋白,利用western blot法检测DNMT1的蛋白表达量,并在过表达miR-217的年青组HSF中,转染DNMT1-cDNA质粒,衰老β-半乳糖苷酶染色法检测HSF的衰老相关染色率。结果：MICRORNA.ORG网站预测到miR-217的3’UTR区域可以直接靶向DNMT1的序列。荧光素酶报告基因检测显示,野生型的DNMT1-3’UTR质粒转染后,过表达miR-217后,荧光量较未过表达组下降(P<0.05),而突变型的DNMT1-3’UTR转染组未发生明显变化。年青组HSF中抑制DNMT1的表达量后,细胞增殖能力明显减弱(P<0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明显上升(P<0.01)；年青组HSF中过表达miR-217后,DNMT1的蛋白表达量明显下降(P<0.01)；同时转染含hsa-miR-217shRNA和DNMT1-shRNA序列的慢病毒载体后,较单独下调hsa-miR-217组,衰老β-半乳糖苷酶染色率上升(P<0.05)。结论：DNMT1是miR-217的调控的靶基因,miR-217可直接靶向结合DNMT1的3’UTR区；传代衰老的HSF中DNMT1表达量明显下降,抑制DNMT1的表达量后,可以明显促进HSF的衰老；miR-217通过抑制DNMT1的表达量从而促进HSF的衰老。