类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种系统性免疫疾病,在RA的病理过程中,血管生成起到了极大的推动作用,不仅可为增生的滑膜细胞提供更多的氧气和营养物质,还为炎症因子的散布提供了更多的渠道,如何抑制关节滑膜中血管的增生已成为了RA治疗过程中亟需解决的重要问题。从豆科植物中提取的一种天然化合物—染料木素(Genistein,Gen)被证实具有抑制肿瘤血管生成及RA炎症的作用,但其对RA中血管生成的影响及相关的分子机制仍然有待进一步阐明。本研究对染料木素在体外的抗血管生成活性及其机制进行了初步研究。为确保染料木素的实验浓度处于安全范围内,实验首先采用CCK-8法检测不同浓度染料木素在24h和48h内对MH7A及EA.hy926细胞存活率的影响,实验结果表明,在48h内,染料木素的最高安全实验浓度为25μg/ml。课题组前期研究表明染料木素对炎症因子IL-6具有一定的抑制作用,IL-6是JAK/STAT通路的重要上游因子,对VEGF的表达可能具有一定的影响。实验用TNF-α刺激MH7A细胞,并通过荧光定量PCR及ELISA方法验证染料木素是否能够同时抑制IL-6与VEGF的表达。研究结果表明在TNF-α刺激下,MH7A细胞中IL-6和VEGF的表达显著上调,经染料木素处理后可有效逆转此现象,提示染料木素除在抑制炎症发展方面具有良好功效外,对炎症环境中的血管生成也具有潜在的抑制作用。IL-6是RA病程中的重要炎症因子,同时对血管生成亦具有一定的促进作用,实验采用IL-6模拟炎症及促血管生成环境,在IL-6刺激的条件下进行划痕实验、Transwell及基质胶成血管实验,并验证染料木素是否能够抑制血管生成。实验结果表明,在IL-6刺激下,血管内皮细胞的迁移和成管作用均有明显的增强,经染料木素处理后则可抑制血管内皮细胞的迁移和成管,表明染料木素可对炎症环境中的血管生成产生抑制作用。为更好的模拟RA患者的体内环境,实验采取MH7A与EA.hy926细胞共培养的方式进一步探究染料木素对RA中血管生成的影响。实验结果表明,单纯的TNF-α处理或单纯的与MH7A进行共培养均能促进EA.hy926细胞的迁移,用TNF-α处理MH7A细胞后再与EA.hy926细胞进行共培养时,EA.hy926细胞过膜数量进一步增加,在此基础上用JAK/STAT通路抑制剂AG490处理MH7A细胞后,EA.hy926细胞过膜数量显著下降,表明阻断MH7A细胞中的JAK/STAT通路后,MH7A细胞培养液中促进EA.hy926迁移的物质含量有所下降。染料木素抑制EA.hy926细胞迁移的作用效果与AG490具有一致性,提示染料木素可能通过JAK/STAT通路抑制MH7A细胞分泌促血管生成因子,从而抑制血管内皮细胞EA.hy926的迁移。为进一步验证染料木素抑制RA血管生成的作用机制,实验采用IL-6刺激细胞以模拟炎症及促血管生成环境,通过荧光定量PCR及ELISA方法验证染料木素是否能够在IL-6刺激的条件下抑制MH7A细胞中VEGF、JAK2和STAT3的表达,并通过细胞免疫荧光实验验证染料木素是否能够在IL-6刺激的条件下抑制MH7A细胞中p-STAT3的核转位。实验结果表明,用染料木素及JAK/STAT通路的抑制剂AG490处理MH7A细胞后,VEGF的表达明显下调,同时VEGF的蛋白分泌量也显著下降。通过细胞免疫荧光对p-STAT3进行染色后,发现染料木素可以抑制IL-6刺激下MH7A细胞中p-STAT3的核转位,表明染料木素对IL-6下游的JAK2/STAT3通路具有一定的抑制作用。综上所述,本文的研究结果发现染料木素可有效抑制RA中血管内皮细胞的迁移和成管,并在MH7A细胞中作用于IL-6下游的JAK2/STAT3通路,抑制p-STAT3的核转位,从而抑制VEGF的表达,在炎症环境下起到了抑制血管新生的作用。因此,本文进一步验证了染料木素在炎症环境中抑制血管生成的重要作用,并揭示了染料木素发挥这一作用的潜在分子机制,为染料木素作为RA治疗药物的前景提供了理论支持,同时也为染料木素在其它血管生成相关疾病中的作用提供了理论参考。