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益生菌对肠黏膜的粘附是其发挥生物屏障、营养、免疫、抗肿瘤等生物学功能的基础。因此研究益生菌的粘附作用对开发高效、安全的微生态制剂提供了必要的理论依据和技术支持。
本试验以植物乳杆菌为研究对象,首先采用盐凝聚法(SAT)和微生物粘着碳羟化合物法(MATH)测定了4株乳酸菌(植物乳杆菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌)的表面疏水性,作为细菌粘附力高低的初筛指标。结果显示,两种方法测定均是植物乳杆菌的疏水性最高,SAT测定时植物乳杆菌在0.1mol/L.的(NH<,4>)<,2>SO<,4>中凝聚,为高疏水性细菌;MATH测定疏水性H%达到35.34±3.00。随后采用革兰氏染色法检测了这4株菌对体外培养的上皮细胞Caeo-2细胞的粘附,植物乳杆菌的粘附力最强,达9.6±0.02CFU/细胞,所以细菌表面疏水性可以作为细菌粘附力的初筛指标。
在此基础上我们研究了不同浓度、时间、灭活方法和生化试剂处理对植物乳杆菌粘附力的影响。植物乳杆菌对Caeo-2细胞的粘附有明显的浓度和时间依赖性,粘附2h后达到饱和; 100℃水浴10min灭活和紫外照射30min灭活后植物乳杆菌仍能很强的粘附于Caco-2细胞表面,但植物乳杆菌菌液经胰蛋白酶、高碘酸钠处理以及菌体用磷酸缓冲液(PBS)悬浮后粘附数急剧降低(p<0.01)。说明其粘附素极有可能是糖蛋白类物质,存在于细菌表面及其耗尽培养上清中,且对热和紫外线不敏感。胰蛋白酶漂洗细胞也极显著降低了该菌对Caco-2细胞的粘附(p<0.01),但高碘酸钠漂洗细胞对该菌的粘附影响不显著(p>0.05),揭示细胞上的粘附素受体可能是蛋白质,但葡萄糖、乳糖、果糖、甘露糖均极显著降低植物乳杆菌对细胞的粘附,其中又以甘露糖最为显著,表明Caeo-2细胞上的粘附素受体可能含有这四种糖相似的结构,所以细胞上粘附素受体还有待进一步研究。
作为益生菌须对病原菌有抑制作用,我们研究了不同处理的植物乳杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌粘附的抑制作用。植物乳杆菌发酵液、耗尽培养上清液、100℃水浴10min灭活、紫外照射30min灭活的植物乳杆菌发酵液和磷酸缓冲液(PBS)悬浮的植物乳杆菌菌体对大肠杆菌粘附Caco-2细胞的抑制率分别为71.2%、69.2%、65.2%、70.6%、37.2%;对沙门氏菌粘附的抑制率分别为90.9%、91.4%、95.1%、91.8%、88.4%,而和植物乳杆菌发酵液相同pH的醋酸和乳酸混合液对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制率仅分别为22.3%和24.1%。由此可知无论是存活还是死亡的植物乳杆菌均能极显著(p<0.01)抑制大肠杆菌和沙门氏菌对Caco-2细胞的粘附;植物乳杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制并非主要是发酵液中含有的有机酸发挥作用;抑制大肠杆菌和沙门氏菌的粘附的物质存在于细菌表面和其耗尽培养上清中;乳酸杆菌的占位性保护机制也是抑制两种致病菌粘附的重要因素。