第一部分结肠癌相关差异性通路内关键基因筛选研究背景结肠癌(coloncancer,CC)是发生在结肠部位的癌症,通常始于良性肿瘤,往往以息肉的形式存在,而随着时间的推移产生癌变,具有发病率高、预后不良、受遗传及环境因素影响等特点。全球范围内,结肠癌是第三常见的癌症,占所有癌症病例的10%左右。据统计每年约有136万新发病例,大约有694,000人死于这种疾病。结肠癌在发达国家更为常见,超过65%的病例出现在发达国家。治疗结肠癌的方法主要包括手术、放化疗和靶向药物治疗等,但对于进展期结肠癌总体疗效欠佳,许多病人对放化疗及靶向药物治疗产生抗性。因此,寻找更加可靠、有效的靶点基因对于优化结肠癌患者的治疗方案及改善预后至关重要。研究显示,与正常组织样本相比,结肠癌肿瘤组织中有数百个通路(pathway)表达异常。有一种简单的确定差异表达通路的方法是对肿瘤样本与数据库归纳的正常样本数据进行比较,其基本原理是量化个体样本的异常通路。传统个体化的通路分析方法要求较为严格,需要同时分析来源于同一活体完全匹配的的肿瘤组织和正常组织。Khatri等人将这些方法分为三大类:它们分别是基于比例过高分析(overrepresentation analysis,ORA)、功能归类评分(functional class scoring,FCS)、通路拓扑(pathway topology,PT)的方法。这些通路分析方法用来确定哪些基因在肿瘤样本中的表达与正常组织样本相比存在差异,而不能确定某一特定基因在不同肿瘤样本中的不同表达量,因此针对基因表达数据分型的研究一直是受限的。还有两项有关个体化通路分析的研究:PARADIGM是一种用已知的功能性结构来推断通路状态的工具。由于该方法是利用基因DNA和蛋白之间的已知功能联系来工作的,所以这种方法不适用于利用单个层面的数据进行分析;另一个方法是由Drier等人提出的个体化通路失调评分(PDS)。为了准确计算PDS评分,需要一系列数据预处理步骤,包括选择需要使用的主成分数量和过滤背景基因数据以获得优化的主曲线,需要使用大量数据来解释单个患者的数据;另外当它用来解释单一样本时有局限性,比如病人的复发性肿瘤并没有相应的整套数据用来提取主曲线。研究目的在我们的研究中,利用数据库中归纳的正常样本数据,将个体化差异表达通路评分(individualized pathway aberrance score,iPAS)的方法运用在结肠癌样本分析中。通过使用差异共表达网络(DCEN)结合通路分析,筛选出关联性最强差异表达基因。材料与方法从GEO数据库获得的56个结肠癌组织和55个周围非肿瘤组织样本的RNA转录谱(GSE44861)以及对应的样本相关信息。结果经过微阵列数据线性模型(Linear models for microarray data,LIMMA)筛选明显差异表达的基因。进一步,通过基因富集分析获取差异基因富集的通路:从KEGG生物信号通路数据库获得能够代表生物学信号通路的基因表达信息,采用富集分析检验的统计手段,筛选差异表达基因中显著性富集的通路。然后,将个体化通路分析的方法运用在结肠癌样本分析中。主要可分为四个步骤:数据预处理、基因表达量检测、个体化通路异常评分(iPAS)、通路显著性检验。反映一个癌症样本和许多正常样本的差异情况。最后,我们基于表达谱,使用经典贝叶斯模型进行共表达基因对的鉴定,得到共表达异常的基因对,构建差异共表达网络结构。同时,计算差异共表达网络的聚类系数和介数中心性等拓扑学属性指标。结合通路分析和共表达网络结果,将差异通路内的差异基因组成的共表达网络进行深入分析,进一步获取通路内的潜在调控关系,筛选关联性最强的基因。结果根据我们规定的筛选标准(即P值≤0.01且倍数变化的log值不得小于2),一共有485个基因在结肠癌患者中的表达量有显著差异。其中,194个基因上调,291个基因下调。其中上调最明显的基因是白介素8(IL8),它通常被视作肿瘤坏死因子的表达变量;下调最明显的基因为GCG,以往实验证明其与多种肠道疾病有关。在这485个差异表达基因中,有245个基因主要富集在一些特殊的通路中,而这些通路是由这485个差异表达基因及1004个主要通路的交集组成的,即这些通路是我们发现的结肠癌患者485个差异基因所涉及的通路。差异基因通路分析发现三条通路即化学物致癌作用通路、p53信号通路和细胞色素P450代谢通路,可能与结肠癌发病关系密切。个体化通路分析显示p53信号通路的差异基因在结肠癌发生发展中可能有重要的意义。通过“TP53基因相关通路”的鉴定,表明了基于通路的癌症基因鉴定是可行的。通过对从111个微阵列数据组中鉴定出的485个差异表达基因进行共表达分析,我们得到了 4612对有共表达关系的基因,这其中涉及到的差异表达基因有480个。结果表明差异表达关系网普遍覆盖了众多的信号通路,并且相关联的通路之间存在相互依赖的功能关系。有很多基因参与了不同的共表达关系,即同一个基因可能与多个不同的基因有共表达关系,即在多个共表达关系对中出现。共表达关系网中连通度前5的基因:QPCT、SFN、SPINT1、GOT1、SLC22A18。据统计这几个基因与一些常见癌症有密切关系。差异通路内基因组成的共表达网络中,连通度最高的5个基因:SFN、GOT1、CFI、STAM、VDR,且均与癌症相关。其中,SFN连通度最高,居于p53通路差异表达网络中心,与p53通路和通路外基因均存在复杂关联,虽然不存在于化学致癌通路和细胞色素P450通路中,但根据通路关系图,SFN与这两个通路中基因存在复杂相互关系,这三个通路富含差异表达基因,在结肠癌发生发展中可能有非常重要的作用,且差异共表达网中大多数基因都与许多癌症的发生相关。结论1.差异表达基因通路分析发现三条通路即化学物致癌作用通路、p53信号通路和细胞色素P450代谢通路,可能与结肠癌发病关系密切。个体化通路热图分析显示p53信号通路差异表达频次最高。2.在差异表达基因共表达网络中,SFN居于共表达网络中心,连通度最高,与三大通路中的多个基因均存在复杂关联,可能在结肠癌发病机制中存在重要作用。第二部分SFN基因功能研究研究背景通过差异基因通路分析及共表达网络分析,Stratifm(SFN)基因与癌症发生有较强的相关性,且与其他基因共表达关系明显,并且在细胞分裂等众多癌症相关通路特别是p53通路中富集,可能参与结肠癌的发生过程。SFN基因在生物体内编码的蛋白为14-3-3σ(Stratifin,SFN)蛋白。SFN蛋白首先在分层角质细胞中被鉴定出来,且在这种细胞中的高表达较其他细胞高,所以也被称为Stratifin/SFN蛋白。1997年,SFN基因首先作为p53转录因子的靶向识别因子,引起了人们的广泛关注。由于SFN基因在许多癌症中是表观修饰沉默的基因,它更多地被认为是一个抑癌基因。已有研究表明其与结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、头颈癌及肺癌的发病有潜在影响。SFN蛋白表达量异常在癌症中广泛存在,那么SFN基因很可能在癌症发生和发展过程中起重要作用。研究目的根据我们用生物信息学分析得出的结论可知,SFN基因在结肠癌中倾向于下调,而且SFN居于差异表达基因共表达网络中心,连通度最高。因此,我们进一步研究了其在结肠癌中的表达及相关生物学意义。材料与方法取我院35例患者结肠癌组织及周围临近正常结肠组织,分别用定量RT-PCR和western blot检测同一患者两种组织中SFN在mRNA和蛋白水平上的表达情况,判断SFN是否在结肠癌组织中下调。总结、分析这35例结肠癌患者的临床病理特征,包括患者性别、年龄、肿瘤大小及组织类型、分化程度高低以及TNM分期等。依次判断SFN蛋白在结肠癌组织中的表达量是否与各个临床病理特征相关。体外验证SFN在结肠癌细胞中表达:选取三种结肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116,以及NCM460正常结肠上皮细胞,用western blot检验SFN蛋白在各细胞中的表达量,体外验证SFN是否在结肠癌细胞中下调。并根据实验结果选出代表性结肠癌细胞系SW480进行后续实验。评估SFN对细胞增殖、凋亡及细胞周期分布的影响:分别在SW480细胞过表达、沉默SFN基因,用CCK-8实验测定各细胞的生长情况;用流式细胞仪测定各细胞的凋亡情况。流式细胞方法检测转染细胞的凋亡情况及对细胞周期分布的影响。检测SFN过表达后凋亡相关通路的活性变化:已知SFN在p53通路中富集,western blot检测p53通路激活情况。并检测相关调控因子MDM2和凋亡因子Bax蛋白的表达情况,从而判断SFN影响细胞存活的分子机制。在体实验验证:SW480细胞转染不同质粒(pIRES-EGFP空载体、pIRES-SFN过表达质粒、未转染细胞)分别进行裸鼠接种。每7天测一次荷瘤裸鼠的体重;同时测量肿瘤的长、宽度,计算肿瘤体积。一个月后用颈椎脱臼法拉颈处死各组裸鼠,剥离肿瘤组织用于后续试验:将各组皮下移植瘤称重进行对比;计算肿瘤抑制率;免疫组化检测肿瘤组织中Bax及Ki67的表达;原位末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果SFN在结肠癌组织、细胞中低表达:在35例患者的结肠癌组织与周围正常组织比较,SFN在蛋白和mRNA水平上的表达量均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。体外验证结肠癌细胞中SFN的表达情况:SFN在SW480、SW620、HCT116结肠癌细胞系中的mRNA、蛋白表达量比NCM460正常结肠上皮细胞系有明显降低(P<0.05)。其中,以SW480细胞最为明显,于是我们采用SW480细胞系作为后续研究的结肠癌细胞模型。SFN过表达可以体外抑制细胞增殖、加强细胞凋亡并影响细胞周期:CCK-8检测结果显示,转染过表达pIRES-SFN的细胞相比未转染细胞增殖受到抑制,而转染GIPZ慢病毒shRNA的细胞增殖明显增加。说明SFN在结肠癌细胞中对细胞的增殖起抑制作用。V-FITC/PI流式细胞术分析可知,过表达SFN后细胞凋亡比例大幅增加。此外,转染GIPZ慢病毒shRNA的细胞凋亡比例减小,该细胞中SFN基因被沉默,因此可以看出SFN基因在细胞凋亡中起促进作用。利用流式细胞仪分析了 SFN转染对细胞周期的影响:SFN转染48小时后,处于G2/M期的细胞比例上升;G1期细胞的数量受SFN过表达的影响而显著减少。SFN通过调节p53通路活性抑制细胞活力:Western blot检测结果显示,过表达SFN基因后,SW480细胞中p53蛋白的表达水平有所增加且磷酸化p53所占比例也有所增加,而MDM2的表达水平明显降低,而促凋亡分子Bax蛋白表达水平明显升高。由于MDM2可结合p53将其泛素化并降解,且p53的磷酸化形式与乙酰化一起是其活化的基本形式,我们判断SFN过表达可通过下调MDM2使p53增加并活化p53通路,从而调节细胞活性。体内异体移植肿瘤细胞研究SFN对肿瘤的生长、凋亡及相关通路的影响:各组裸鼠体重均无明显差异。而通过对皮下移植瘤体积的记录结果显示,SFN转染组相对于未转染组(空白对照组)和其他两组移植肿瘤,增长速度显著减缓,有统计学差异。另一方面,瘤体经过一个月生长,未转染组的平均瘤重达到了1.27g,而转染有SFN的肿瘤细胞移植后,表现出对瘤体的抑制作用,抑瘤率达到了 65.35%,且相对于空白对照组有统计学意义;转染空载体组与未转染组相比没有明显差异。结果提示,SFN对肿瘤细胞的在体生长有强抑制作用。TUNEL实验中,光镜下细胞核染为棕黄色颗粒为凋亡细胞。计算凋亡率,结果显示SFN转染细胞移植组中凋亡程度高于其他组,与其他组均有统计学差异(P<0.05)。结果说明SFN能够诱导肿瘤细胞凋亡。结论SFN基因在结肠癌组织和细胞中表达量显著下调;SFN基因通过调节p53通路诱导细胞周期在G2/M期停滞、抑制细胞增殖、并诱导细胞凋亡,从而抑制结肠癌细胞的体内增殖。虽然SFN基因在结肠癌发生过程中的作用机理还不明确,不过随着相关基因技术的发展,其在肿瘤中的作用会被进一步认识,有可能成为结肠癌新的基因治疗靶点。