背景黑色素瘤是由位于表皮基底层的黑色素细胞恶变而发生的,其在皮肤和黏膜的痣、斑内黑色素细胞形成的微囊均有恶变的可能。黑色素瘤的发生既有遗传因素,又有紫外线照射等环境因素。近年来,黑色素瘤的发生率及死亡率呈上升趋势。虽然早期黑色素瘤手术切除后的五年存活率很高,但晚期转移性黑色素瘤患者的存活率是很低的。有报道认为黑色素瘤发生时可以检测到Rho家族信号通路的反常,近年来Rho蛋白质及效应物是新型抗癌药物的研反目标。Rho相关蛋白激酶(ROCK)是属于AGC(PKA/PKG/PKC)家族的丝氨酸-苏氨酸激酶,通过作用于细胞骨架来调节细胞的形态和迁移;它还通过多个下游靶点对细胞的存活、增殖和凋亡起到重要的调节作用。已知的哺乳动物ROCK包括ROCK1和ROCK2两种亚型,总体上同源性是62%,激酶域同源性是92%。由于ROCK影响细胞迁移、增殖等多种生物过程,ROCK抑制剂已经过临床效果测试,包括对部分癌症的抑制效果。ROCK抑制剂法舒地尔在日本和中国被批准用于脑血管痉挛的临床治疗。这种靶向治疗或者免疫治疗的方法虽然给黑色素瘤患者带来一些曙光,但因为黑色素瘤的诸多变异,目前仍没有出现令人满意的疗法。有报道称在体外实验中抑制ROCK可以抑制黑色素瘤细胞的迁移、入侵、扩散和生存,而Y-27632作为最广泛应用的ROCK抑制剂被多次报道可以抑制黑色素瘤细胞。然而黑色素瘤的发生发展牵涉到多基因、多信号通路的调控,ROCK抑制剂虽在黑色素瘤的发生发展中扮演了非常重要的角色,其靶向作用明显但机理不明,特别是针对BRAF突变型黑色素瘤效果不佳,成为其过度到黑色素瘤细胞治疗的临床应用的阻力。目前抑制ROCK蛋白的特异性药物抑制剂已被应用于临床来治疗心血管疾病和脑血管痉挛。许多报告表明,在构建的恶性肿瘤的体外模型中,发现了 Rho家族信号通路的下调。参与RhoA信号通路的蛋白在多种肿瘤中显著升高。此外,有报道称Rho信号通路相关蛋白的表达增加有助于某些癌症的转移行为。众所周知,Rho蛋白及其效应因子具有调节细胞骨架的重要功能,是新型抗癌药物开发的重要靶点。以抑制ROCK蛋白为主的靶向治疗方法已被证明可减少肿瘤进展和促进肿瘤细胞死亡。有报道通过体内、体外实验均证明使用一种对ROCK蛋白具有高度特异性的小分子药物抑制剂,Y-27632,在一组皮肤和眼部黑色素瘤细胞系中抑制了肿瘤的发生,并在啮齿动物模型中阻断了黑色素瘤的形成。在前期实验中我们也发现,Y-27632处理的黑色素瘤细胞形态发生了改变,板状伪足减少同时丝状伪足增加。然而恶性肿瘤病理分型众多,同一种临床分类的恶性肿瘤的免疫组化结果更是有诸多不同,不能一概而论。也有报道称ROCK抑制剂Y-27632可以增加SW480结肠癌细胞的迁移。此外,RND3,一种ROCK抑制剂,已经被证明可以增强黑色素瘤细胞的迁移。这些文献报道表明,ROCK抑制剂在不同的黑色素瘤细胞中具有不同的功能,而究竟其作用机理如何,还有待于进一步的研究。因此,在本研究中,我们通过探讨ROCK抑制剂对不同分类的黑色素瘤细胞的影响,进一步探索ROCK抑制剂Y-27632对黑色素瘤细胞的作用机理,以及不同分类的黑色素瘤对其反应为何不同,从而为相关药物在黑色素瘤的临床应用中提供指导意见。第一部分:Rho相关激酶抑制剂对人黑色素瘤细胞的生物学作用[研究目的]研究Rho相关激酶抑制剂Y-27632、法舒地尔对人皮肤黑色素瘤细胞(UACC257、UACC62、MeWo、M14)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F1)、人黑色素细胞(HEM)的迁移和增殖的影响。[研究方法]1.黑色素瘤细胞培养和药物处理:所有黑色素瘤细胞和黑色素细胞(HEM)均在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养,培养基中添加10%胎牛血清和0.1%青霉素/链霉素。Y-27632在蒸馏水中溶解,制得10 mM原液,Y-27632的药物处理浓度为10 μM。2.黑色素瘤细胞迁移和增殖:约7.5×104细胞/毫升的黑色素瘤细胞被复苏在96孔板中,加入10 μM Y-27632或10 μM磷酸盐缓冲液,培养箱中培养,在指定的时间使用细胞计数(CCK8)测吸光光度值以检测细胞增殖。3.划痕实验:关于体外创伤愈合实验如前所述,黑色素瘤细胞被复苏到6孔板上,生长到100%汇合,用无菌吸管尖通过线性划伤去除细胞,并用磷酸盐缓冲液、Y-27632或法舒地尔处理。划痕愈合的过程用数码相机拍照。伤口愈合百分比为愈合面积除以总划痕面积。4.迁移实验:检验Y-27632对黑色素瘤细胞迁移的影响,将细胞(UACC257)以1×105细胞/毫升的密度重悬浮于200 μl的0.1%血清的DMEM培养基中,加入到上室。向下室中加入500 μl含10%磷酸盐缓冲液的DMEM培养基。在37摄氏度下培养24小时。去除滤膜上未迁移的细胞后,将迁移过膜的细胞用4%多聚甲醛固定,洗涤后用0.1%结晶紫染色。在随机选取的6个显微镜场中,计数迁移到下腔的细胞数量。[研究结果]用ROCK抑制剂(Y-27632、法舒地尔)处理不同的黑色素瘤细胞系,通过细胞培养、药物处理、划痕实验、CCK8实验、迁移实验观察药物对不同黑色素瘤细胞增殖、迁移的变化。我们发现ROCK抑制剂可以促进黑色瘤细胞(UACC257、UACC62)的生长及迁移。也可以抑制黑色素瘤细胞(B16)的生长及迁移。因此,ROCK抑制剂的作用是有细胞特异性的,通过对一系列细胞(MeWo、M14、HEM)的检测,我们进一步发现,ROCK抑制剂促进BRAF突变的黑色素瘤细胞的生长及迁移,同时抑制野生型BRAF基因的黑色素瘤细胞的生长及迁移。[研究结论]在体外实验中,ROCK抑制剂可以促进BRAF突变的黑色瘤细胞(UACC257、UACC62、M14)的生长及迁移,也可以抑制野生型BRAF基因的黑色素瘤细胞(B16、HEM、MeWo)的生长及迁移。因此,ROCK抑制剂的作用是有细胞特异性的,在很大程度上取决于细胞类型。提示ROCK抑制剂在临床应用中应注意规避BRAF突变型黑色素瘤患者。第二部分:RHO相关激酶抑制剂Y-27632对BRAF突变的人黑色素瘤细胞株的影响[研究目的]探讨Rho相关激酶抑制剂Y-27632对BRAF突变的人黑色素瘤细胞株的作用机理[研究方法]通过RT-PCT筛选出有效下调ROCK的小干扰RNA,用小干扰RNA阻断ROCK1和ROCK2在黑色素瘤细胞中的表达,再通过ELISA试剂盒检测经过小干扰RNA处理后的黑色素瘤细胞中ROCK1和ROCK2的活性。用ROCK活性被抑制的黑色素瘤细胞进行划痕实验及CCK8增殖实验,观察ROCK1或ROCK2下调,或者ROCK1/ROCK2同时下调,对黑色素瘤细胞的生长的影响。发现对黑色素瘤细胞的一系列促进作用是ROCK抑制剂引起的之后,我们用蛋白质免疫印迹法,检测了加入ROCK抑制剂Y-27632后,PI3K/AKT/mTOR通路和RAF/MEK/ERK通路中一系列蛋白的变化,通过观察ROCK抑制剂对黑色素瘤细胞产生促进或者抑制作用的效应蛋白的条带结果,筛选出起关键作用的效应蛋白:ERK及AKT。然后,我们在Y-27632和AKT或者BRAF或者ERK通路抑制剂的作用下培养UACC257黑色素瘤细胞并进行划痕实验、迁移实验、CCK8实验,最后将实验数据进行统计学分析,以进一步验证ROCK抑制剂与AKT、ERK、BRAF之间的关系以及探究它是如何通过影响三者完成对不同黑色素瘤细胞产生不同作用的。[研究结果]在B16F1细胞中,Y-27632对ATK/mTOR通路没有显著影响,在Y-27632处理后的早期ERK的活性确实出现了显著的降低。在野生型BRAF基因的人类黑色素瘤细胞MeWo中,AKT活性未发现明显变化,ERK活性出现降低。在UACC257细胞中,Y-27632处理后的ATK的活性,特别是在Thr 308和Ser473位点处的磷酸化ATK的活性显著增加,同时ERK的活性未见降低。在有BRAF突变基因的人类黑色素瘤细胞UACC62中,磷酸化AKT活性显著增加,同时ERK活性也有适度的增加。在Y-27632和AKT或者BRAF或者ERK通路抑制剂的作用下培养UACC257黑色素瘤细胞,发现AKT或者BRAF或者ERK通路抑制剂均不同程度的抑制了 Y-27632对黑色素瘤细胞的增强生长的作用。此外,当UACC257细胞在Y-27632和其他抑制剂的共同作用下进行体外创伤愈合实验时,我们发现AKT抑制剂部分阻断了 Y-27632对黑色素瘤细胞的促进创伤愈合的能力。BRAF抑制剂PLX4032和ERK抑制剂Sorafenib均能抑制Raf/ERK通路,这两种抑制剂可以完全阻断Y-27632对黑色素瘤细胞创伤愈合的增强作用。[研究结论]通过活性检测结果显示,下调黑色素瘤细胞中的ROCK1/2活性,可以促进BRAF突变型黑色瘤细胞的生长及迁移的能力。通过蛋白质免疫印迹法,最终发现ROCK抑制剂通过激活ERK及AKT通路来促进BRAF突变的黑色素瘤细胞的生长及迁移,同时通过抑制ERK通路来抑制BRAF野生型黑色素瘤细胞的生长及迁移。这在之前未见报道。该部分为ROCK抑制剂治疗BRAF野生型黑色素瘤提供了理论依据。第三部分:Y-27632对人黑色素瘤细胞株(UACC257、MeWo)成瘤能力的影响[研究目的]通过体内实验,进一步探讨Y-27632在黑色素瘤发展过程中的作用。[研究方法]8周龄裸鼠随机分为对照组(仅PBS组,3只小鼠)或药物治疗组(PBS中加入Y-27632,3只小鼠)。将100万个UACC257/MeWo细胞皮下注射到小鼠背部皮肤,每只小鼠注射6次(3)。实验组为含Y-27632的PBS(10 mg/kg)腹腔注射,每周3次,连续2周;对照组为PBS(10 mg/kg)腹腔注射,每周3次,连续2周。移植后3周处死小鼠,收集肿瘤并称重。[研究结果]在UACC257黑色素瘤细胞体内实验中,经过Y-27632腹腔注射后的裸鼠模型里,黑色素瘤的成瘤率为100%,而对照组成瘤率为约80%。且实验组肿瘤的平均重量及体积均大于对照组,重复三次实验后进行统计学分析,P<0.001。在Me Wo黑色素瘤细胞体内实验中,两组成瘤率均约为100%。经过Y-27632腹腔注射后的裸鼠模型里,实验组肿瘤的平均重量及体积均小于对照组,重复三次实验后进行统计学分析,P<0.01。[研究结论]ROCK抑制剂体外给药可显著增加裸鼠模型中BRAF突变的黑色素瘤的发育速度,同时抑制BRAF野生型黑色素瘤的发育速度。通过体内实验结果,进一步证实:ROCK抑制剂Y-27632对BRAF突变的黑色素瘤细胞的有促进作用,对BRAF野生型黑色素瘤细胞有抑制作用。因此我们认为ROCK抑制剂作为一种治疗工具是肿瘤特异性的,我们的研究结果提示:ROCK抑制剂在临床应用中应注意规避BRAF突变型黑色素瘤患者,同时为ROCK抑制剂治疗BRAF野生型黑色素瘤提供了理论基础。