角膜基质细胞感染茄病镰刀菌后拉曼光谱分析及真菌毒素检测

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目的:体外模拟真菌感染角膜的过程,研究角膜基质细胞受茄病镰刀菌感染后生化物质组成的变化,以及细胞培养液中镰刀菌酸(FA)、伏马毒素B1(FB1)、呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEA)等四种毒素的表达,进一步探讨真菌性角膜炎的发病机制。方法:1、应用消化法对角膜基质细胞进行传代培养,倒置相差显微镜下观察细胞体外生长特性;制备茄病镰刀菌液,体外模拟真菌感染角膜的过程,并设置空白对照组;2、应用RenishawinVia型共聚焦显微拉曼光谱仪,获得茄病镰刀菌液感染角膜基质细胞后1d、2d拉曼光谱,分析比较各自的平均光谱;3、在第1、3、5d分别采用液相色谱—串联质谱法依次检测细胞培养液中FA、FB1、DON、ZEN等四种毒素的表达。结果:1、倒置显微镜下观察可见感染组细胞内颗粒明显增多,细胞出现皱缩、脱落。5d后茄病镰刀菌菌丝完全覆盖细胞层,无法观察细胞形态。2、感染组细胞的平均拉曼光谱与正常细胞组在位置和形状上类似,但某些特征峰强度下降,体现在1005cm-1、1186cm-1、1657cm-1、1449cm-1和1311cm-1,分别属于苯丙氨酸、酪氨酸、α-螺旋、细胞膜磷脂质和核酸碱基。3、在感染细胞后的第5天,采用液相色谱一串联质谱法从镰刀菌与细胞共培养液中毒素检测出FB1和DON,未检测出FA和ZEA。结论:1、茄病镰刀菌具有较强的细胞毒性,细胞经过真菌的处理,细胞蛋白质的合成被抑制,细胞膜结构改变,细胞的遗传物质受到破坏,细胞发生死亡。2、茄病镰刀菌可在与角膜基质细胞共培养时产生FB1和DON,不产生FA和ZEA,或其含量未达检出限。真菌毒素可能在真菌性角膜炎的发生发展中发挥重要作用。
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