背景:放射治疗是肿瘤现代治疗的主要手段之一,在肿瘤治疗的适应症非常广泛。放射治疗即可做为局限期肿瘤或孤立转移性肿瘤的根治性治疗手段,也可做为晚期肿瘤的姑息治疗手段。随着放射治疗技术、计算机技术和医学影像学的发展,肿瘤放射治疗的疗效取得了明显的进步。研究放射线对肿瘤的影响和具体机制已成为肿瘤治疗的重要课题。根据传统观点,射线照射可以直接影响DNA双螺旋的结构,从而激活DNA损伤传感器,诱导细胞凋亡、坏死和衰老。最近的研究表明,射线照射还可以改变存活肿瘤细胞的表型和微环境,从而改变癌细胞的生物行为。免疫检查点抑制剂（ICI）的出现是近年来肿瘤治疗领域取得的突破性进展。目前上市的免疫检查点抑制剂包括PD-1/PD-L1抗体和CTLA-4抗体。近年来ICI和其他手段联合的多模式综合治疗逐渐成为主流。PACIFIC临床Ⅲ期随机对照试验显示,针对局部晚期非小细胞肺癌,在铂类为主的放化疗后,加用PD-L1抑制剂巩固治疗,患者可同时获得疾病无进展生存期和总生存期延长。通过放射治疗增强ICI疗效的机制包括肿瘤微环境的免疫调节和原位疫苗接种等,患者接受放射治疗后,肿瘤体细胞突变,肿瘤突变负荷（TMB）升高,而肿瘤突变负荷与肿瘤免疫治疗的疗效反应独立相关。肿瘤突变后产生新抗原的可能性增大,文献证明突变后抗原多肽片段免疫原性与各种肿瘤类型的细胞毒性T细胞抗肿瘤反应明显相关。例如在治疗难治性转移性NSCLC中,CTLA-4抗体联合放射治疗时,可以通过放射治疗诱导肿瘤细胞免疫原性突变暴露于免疫系统,进而激活诱导全身性T细胞反应。放射治疗诱导的TMB升高并不能充分解释检查点抑制剂和放疗相结合后导致的疗效提高。未行放射治疗的高TMB肿瘤对检查点抑制剂的疗效反应变化很大。还存在别的因素同时影响免疫治疗的疗效。放射治疗后肿瘤的克隆状态可能影响免疫检查点抑制剂疗效的另一个重要因素,文献证明克隆性（非亚克隆）肿瘤新抗原的高负荷与机体T细胞反应相关,并会带来检查点抑制剂的临床获益,提示了克隆性抗原在免疫治疗中的重要地位。越来越多的证据促使我们探讨放射治疗与免疫检查点抑制剂联合治疗模式导致疗效增强的潜在机制。我们假设放射治疗通过多种机制增强ICI疗效,包括增加TMB,增强新抗原表达和通过选择放射耐受克隆来降低肿瘤克隆增殖数目。在此我们设计了一个未经照射和两个射线照射后具有低、高不同克隆数目特点的,共三个黑色素瘤同源小鼠的不同分组,探讨照射后TMB和肿瘤克隆数目变化对ICI治疗肿瘤疗效的影响。方法:体外模拟临床放射治疗分割模式,给予母系黑色素瘤B16F10细胞非完全致死照射剂量（5Gy×3次）,在每次照射后进行克隆增殖实验,收获低克隆数目肿瘤细胞（命名为Irradiated-L）和高克隆数目肿瘤细胞（命名为Irradiated-H）分别进行培养传代。将射线照射后不同克隆数目的两个细胞系以及母细胞系（Parental）同等数量的黑色素瘤细胞分别接种到C57BL/6J免疫功能正常的小鼠右腹背侧,创建低克隆性肿瘤、高克隆性肿瘤和未经照射黑色素肿瘤的三种同源小鼠,分别命名为Irradiated-L组、Irradiated-H组和Parental组。每个组的小鼠再分为四个治疗组,分别为对照组（无药物治疗组）,α-PD-L1组,α-CTLA-4组和α-PD-L1+α-CTLA-4（双ICI）治疗组。待荷瘤小鼠的肿瘤可触及后,分别给予对照,α-PD-L1抗体,α-CTLA-4抗体和双ICI抗体治疗。自给药当日开始由不了解具体分组的实验室合作人员测量肿瘤大小,每周三次,直至肿瘤生长达到终点事件,并记录小鼠生存期。使用GraphPad软件（prism 8）two-way ANOVA分析肿瘤生长曲线的时间和肿瘤体积变量,并进行Bonferroni的多重比较校正。使用Kaplan-Meier方法生成生存曲线,并使用对数秩（Mantel-Cox）检验进行比较。对Irradiated-L、Irradiated-H和P arental肿瘤进行CD4、CD8染色观察不同组别基线水平的淋巴细胞浸润情况。对I rradiated-L肿瘤各治疗组行CD4和CD8免疫组化染色,观察免疫检查点药物治疗后对其影响。并提取Parental和Irradiated-L肿瘤标本DNA、RNA分别进行全外显子测序、全转录组测序和配对标本分析及新抗原预测探讨放射治疗对影响免疫检查点抑制剂疗效的因素。结果:1、三组黑色素瘤小鼠肿瘤生存及淋巴细胞浸润:Parental、Irradiated-L和Irradiated-H组小鼠中位生存期分别为18、22.5和22天,三组间有显著差异（p=0.0015）;与 Parental 相比,Irradiated-L 和 Irradiated-H 均呈现显著的生长延缓（p=0.0008和0.013）。肿瘤组织中CD4阳性T淋巴细胞计数Irradiated-L明显高于Parental 组（p=0.01）。CD8 阳性 T 淋巴细胞数在 Irradiated-L 和 Irradiated-H 均高于Parental组（p＜0.0001,＜0.0001）。2、黑色素瘤小鼠对不同免疫检查点抑制剂的反应:1)Parental:对照组、α-PD-L1、α-CTLA-4和双ICI治疗的中位生存期分别为18、20、21.5和21天。与对照组比未显示出生存获益。2)Irradiated-L:对照组、α-PD-L1、α-CTLA-4和双ICI治疗的中位生存期分别为22.5、26、34和38.5天。应用双ICI时,肿瘤生长呈现出明显的延缓趋势（p=0.0047）,α-PD-L1、α-CTLA-4和双ICI组与对照组相比,黑色素瘤小鼠的生存期均显著延长（p=0.04、0.004和0.005）。3)Irradiated-H:对照组、α-PD-L1、α-CTLA-4 和双 ICI 治疗组中位生存期分别为22、25、26.5和28.5天（p=0.02）。α-CTLA-4显示出延长生存的趋势（p=0.0597）,双ICI治疗显示出生存获益（p=0.0075）。配对比较中,与Irradiated-H相比,Irradiated-L小鼠在双ICI治疗组中的总生存时间更长（p=0.045）。4)不同治疗组Irradiated-L小鼠肿瘤组织内淋巴细胞浸润情况:对Irradiated-L的4个治疗组小鼠肿瘤组织CD4和CD8免疫组化分析得出CD4在α-CTLA-4组和双ICI组有显著升高,CD8在各个治疗组中均有显著升高。3、全外显子及转录组测序分析结果:通过对Irradiated-L和Parental肿瘤进行全外显子、转录组测序并进行样本间的对比分析和新抗原预测得到:Irradiated-L组较Parental组的肿瘤增加了 618个外显子突变并且伴有VAF（Variant Allele Frequency）的升高。对照射前后配对标本进行的新抗原预测提示射线照射诱导黑色素瘤细胞出现低于相应野生型表位的半最大抑制浓度（IC50）新抗原,并且每种新抗原对应的基因具有高变异等位基因频率（VAF＞0.25）,提示为克隆性新抗原。结论:黑色素瘤细胞照射后小鼠肿瘤生长缓慢,生存期延长,低克隆组更显著,照射后肿瘤组织内CD4和CD8阳性T淋巴细胞浸润增多,CD8阳性T淋巴细胞增多更为显著。免疫检查点抑制剂在照射后的肿瘤中显示出疗效,双ICI的疗效最强。Irradiated-L肿瘤各个治疗组的免疫组化结果提示肿瘤组织中CD4、CD8阳性T淋巴细胞浸润随着免疫检查点抑制剂疗效的增强而增加,CD8阳性T淋巴细胞增加的更为显著。在双ICI治疗组,Irradiated-L小鼠的生存要优于Irradiated-H小鼠,提示ICI疗效随着照射后肿瘤克隆数目的降低而增强。射线照射可以导致肿瘤突变负荷升高并伴有射线照射诱导的肿瘤细胞克隆性新抗原的表达。我们的研究说明,在放射治疗过程中,射线照射可以通过增加肿瘤TMB、诱导新抗原表达以及降低细胞克隆数目来增强免疫系统对肿瘤的识别,提高与ICI联用的疗效。