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研究背景：骨髓间充质干细胞存在于骨髓中，是骨髓造血干细胞微环境中重要的组成细胞，对于骨和软骨的发生有着至关重要的作用。同时骨髓间充质干细胞是一种具有自我复制和多向分化潜能的多能干细胞，它可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至干细胞和神经细胞等跨胚胎层来源的细胞，其生长发育受多种内在机制和微环境的影响。骨髓间充质干细胞适应体内较低的生理氧浓度，而缺氧状态对骨髓间充质干细胞生理特性的影响及其机制如何，目前观点不一。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS）是重要的激素内分泌系统。目前研究显示，不仅局部组织产生RAS，细胞也存在自身的RAS，如心肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞和肺泡上皮细胞等多种细胞上均发现RAS组成成分。细胞通过自分泌或旁分泌等方式对细胞的分化和增殖起重要作用。本实验拟低氧浓度诱导下RAS介导的骨髓充质干细胞增殖及机制作一探讨。第一部分局部RAS在原代培养的骨髓间充质干细胞中的表达目的：观察原代培养骨髓充质干细胞局部RAS的分布与表达。方法：采用密度梯度离心法获得单个单核细胞后再对其进行消化传代培养，采用免疫细胞化学和流式细胞术鉴定细胞性状和纯度，用体外诱导成心肌细胞和脂肪细胞来鉴定其多向分化能力，并分别对其诱导的细胞应用免疫细胞化学方法进行鉴定。绘制原代培养骨髓间充质干细胞的生长曲线，选择最佳实验时间。以免疫荧光染色检测细胞AT1R、AT2R的表达、分布和丰度。以放射免疫检测骨髓间充质干细胞培养液中Ang II和ACE含量。结果：经过鉴定，我们成功分离和培养了纯度>95%的骨髓间充质干细胞，并将骨髓间充质干细胞成功诱导为心肌细胞和脂肪细胞。骨髓间充质干细胞细胞膜上普遍分布有丰富的Ang II受体, AT1R和AT2R。结论：原代培养的骨髓间充质干细胞保持了高纯度且具有多向分化特性。骨髓间充质干细胞中存在局部RAS，包括AT1R和AT2R。第二部分局部RAS对缺氧诱导的骨髓间充质干细胞生长的影响目的：探讨RAS对缺氧诱导的骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响。方法：应用细胞计数法和流式细胞术检测缺氧对骨髓间充质干细胞生长、细胞周期及凋亡的影响；应用RT-PCR方法检测缺氧对骨髓充质干细胞中干性标志物Oct-4、Sox-2和Rex-1mRNA表达的影响；应用放射免疫检测缺氧骨髓间充质干细胞培养液中Ang II和ACE蛋白含量的变化；应用Western-blot检测缺氧对骨髓间充质干细胞中Ang I、Ang II和ACE蛋白含量的影响；将常氧组加入外源性Ang II，将不同浓度Losartan(AT1R阻断剂)和PD123319（AT2R阻断剂）分别作用于常氧组Ang II组和缺氧组的骨髓间充质干细胞，采用细胞计数仪检测骨髓间充质干细胞的数量。结果：3%氧浓度条件下培养72小时后骨髓间充质干细胞S期细胞比率和细胞增殖指数均增高，缺氧组与常氧组相比细胞数量明显增多；维持细胞干性标志物在缺氧组和常氧组骨髓间充质干细胞中均有表达，且缺氧组中Sox-2的表达量较常氧组更高；缺氧组细胞上清液中Ang II和ACE表达量较正常组均显著升高；骨髓间充质干细胞常氧Ang II组和缺氧组中加入Losartan后，部分逆转缺氧和Ang II对细胞增殖的作用。加入PD123319后，对细胞增殖无明显作用。结论：缺氧刺激骨髓间充质干细胞的增殖，且增加其局部RAS的含量；Ang II又通过AT1受体可能介导了缺氧条件下骨髓间充质干细胞的增殖调控。第三部分Ang II对缺氧诱导骨髓间充质干细胞生长及迁移的影响机制目的：探讨RAS对缺氧条件下骨髓间充质干细胞增殖信号通路的调控机制。方法：应用Western-blot方法检测缺氧不同时间点（0h，0.5h，1h，4h，12h，24h)骨髓间充质干细胞PI3K/AKT信号通路的蛋白表达水平。取表达水平差异明显的两个时间点，将Captopril（ACE抑制剂）、Losartan（AT1受体阻断剂）、LY294002（PI3K的特异阻断剂）和PD123319（AT2受体阻断剂）分别作用于常氧Ang II组和缺氧组的骨髓间充质干细胞，检测PI3K/AKT信号通路的蛋白表达；应用Western-blot方法检测骨髓间充质干细胞缺氧不同时间点（1h，4h，12h，24h) HIF-1α和VEGF的蛋白表达。结果：检测不同时间点细胞AKT和p-AKT的蛋白含量中，表明AKT在外源性AngⅡ组和缺氧组均有表达， p-AKT在缺氧或AngⅡ刺激4h时达到高峰，12h后开始逐渐下降，24h时恢复到基础水平；对常氧Ang II组和缺氧组骨髓间充质干细胞分阶段阻断，4h、12h的结果趋于一致，阻断AT1后，常氧AngII组与缺氧组相比，PI3K/AKT信号通路蛋白两组表达显著下降，阻断AT2后，PI3K/AKT信号通路蛋白表达均无明显改变，阻断PI3K后，两组中PI3K/AKT信号通路蛋白表达均显著下降；阻断ACE后，PI3K/AKT信号通路蛋白表达两组均趋于下降；缺氧24h后，骨髓间充质干细胞HIF-1α和VEGF的蛋白表达随着时间延长而增加，阻断AT1后，与不加药组相比，VEGF的蛋白表达显著降低，阻断AT2后，VEGF的蛋白表达无明显改变。结论：Ang II和缺氧对细胞的两种应激方式可能通过同一个信号通路起作用；PI3K/AKT信号通路的激活使其中心分子HIF-1α的上调，可促使细胞核内VEGF表达上调，进而促进细胞的迁移能力。