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雷公藤内酯醇(triptolide,TPL),又称雷公藤内酯、雷公藤甲素,是从雷公藤中提取到的主要活性物质,系一种环氧二萜单体成分。分子式为C20H24O6 ,分子量为360.4。近年来研究表明,其对多种肿瘤细胞具有抗肿瘤作用。早在上世纪70年代,Kupchan等[1]就发现TPL具有显著的抗白血病作用。我们前期的研究也表明,在体外TPL对多种血液系统肿瘤细胞具有良好的诱导凋亡作用,如急性髓细胞白血病细胞株HL-60、U937、K562等,提示TPL在血液系统恶性肿瘤的治疗方面具有潜在的广泛的应用前景。查阅近几年国内外文献,在TPL对淋巴瘤作用方面,仅见有研究发现TPL可以诱导T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat和B细胞淋巴瘤细胞株Raji发生凋亡[2-3] ,但未见TPL对淋巴瘤体内作用的相关研究。因此,本课题以Burkitt淋巴瘤细胞株CA46为模型,研究TPL是否抑制CA46细胞及其裸鼠移植瘤的增殖,并就其作用机制作初步探讨,为TPL的临床应用奠定基础。本文的研究内容主要包括:1. TPL体外对CA46细胞作用的研究:应用MTT比色法、集落形成试验检测0-80ng/mL TPL对CA46细胞增殖能力的影响;应用透射电镜技术、流式细胞术和TdT酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法等检测TPL对CA46细胞凋亡的诱导作用。2. TPL对CA46细胞作用机制的研究: 1)用RT-PCR技术检测经0-80ng/mL TPL作用后CA46细胞bcl-2,bax,c-myc、TGFβ1基因mRNA表达水平的改变; 2)应用ELISA技术检测TPL对CA46细胞培养上清TGFβ1含量的影响。3) Western Blot法检测经0-80ng/mL TPL作用后CA46细胞Bcl-2,Bax,C-myc,Pro-caspase,NF-κb,I-κb蛋白表达水平的改变。3. TPL对CA46细胞裸鼠异种移植瘤作用的研究:使用本研究所传代提供的高致瘤性CA46细胞株,建立CA46细胞裸鼠异种移植瘤模型。实验设2%丙二醇生理盐水阴性对照组,VP-16阳性对照组及高、中、低三个浓度TPL给药组,每组6只裸鼠。给药方式为尾静脉注射。高、中、低浓度给药组分别按每只尾静脉注射TPL 400μg/kg,200μg/kg、100μg/kg进行给药,VP-16阳性对照组每只尾静脉注射VP-16 4mg/kg,阴性对照组注射等量2%丙二醇生理盐水溶液,隔日给药一次,共给药7次。末次给药后24小时,处死裸鼠。称量离体瘤块重量、计算抑瘤率,对瘤组织进行病理学检查等检测TPL对CA46细胞裸鼠异种移植瘤生长的影响;采用透射电镜法检测TPL对CA46细胞裸鼠移植瘤组织细胞超微结构的影响;同时摘除眼球取血检测血常规及肝肾功能,并取心、肝、脾、肺、肾等组织作病理检查以检测TPL对裸鼠的毒性作用。取得了以下主要结果:1. TPL对CA46细胞的增殖具有明显的抑制作用:MTT比色法、集落形成试验均显示ng/mL水平的TPL能明显抑制CA46细胞增殖,且随着药物浓度的升高、作用时间的延长该抑制作用明显增强,呈量效及时效关系。2. TPL可诱导CA46细胞凋亡:透射电镜结果显示,不同浓度TPL处理48小时后,细胞胞浆浓集,染色质固缩,聚集于核膜下,并可见凋亡小体形成;流式细胞术检测显示,随着TPL浓度的增加,细胞凋亡阳性率逐渐增高;TUNEL法检测不同浓度TPL作用CA46细胞48小时,随浓度递增凋亡阳性率逐渐增高。上述结果提示TPL可诱导CA46细胞凋亡。3. TPL可调控CA46细胞凋亡相关基因的表达:RT-PCR显示,分别以20、40、80ng/mL的TPL处理CA46细胞48小时后,c-myc、bcl-2基因的mRNA表达下调,TGFβ1、bax基因的mRNA表达上调,且呈浓度依赖性。4. TPL可调控CA46细胞凋亡相关蛋白的表达: 1)ELISA检测显示:分别以20、40、80ng/mL的TPL处理CA46细胞48小时后,培养上清中TGFβ1分泌量较对照组有上升趋势。2)Western blot检测显示:分别以20、40、80ng/mL的TPL处理CA46细胞48小时后,Bcl-2、C-myc、Pro-caspase、NF-κb,I-κb蛋白表达量减低,Bax蛋白表达量增高。5. TPL可抑制CA46细胞裸鼠异种移植瘤的生长:尾静脉注射TPL 100μg/kg、200μg/kg和400μg/kg时,TPL对CA46细胞裸鼠异种移植瘤的抑制率分别为11.3%(p>0.05)、24.6%(p<0.05)和51.3%(p<0.01),说明低浓度TPL对CA46细胞裸鼠异种移植瘤的生长无明显抑制作用,而中、高浓度TPL对CA46细胞裸鼠异种移植瘤的生长具有抑制作用,且高浓度组较中浓度组明显(p<0.01),呈浓度依赖性;瘤组织病理检查发现,TPL处理组坏死区域较对照组多见,且以高浓度组最为明显;透射电镜发现TPL处理组瘤组织中可见较多凋亡细胞。结论:1. TPL可抑制体外培养的人Burkitt淋巴瘤CA46细胞的增殖并诱导其凋亡;2. TPL抑制体外培养的人Burkitt淋巴瘤CA46细胞的增殖并诱导其凋亡,可能是通过上调TGFβ1,bax的表达,下调bcl-2、c-myc、pro-caspase、NF-κb,I-κb的表达而引起的;3. TPL可抑制CA46细胞裸鼠异种移植瘤的生长,并诱导瘤组织中CA46细胞凋亡。