论文部分内容阅读
研究背景和目的:心脏骤停（Cardiac Arrest,CA）/心肺复苏（Cardiopulmonary Resuscitation,CPR）成功后,由于脑的严重损伤使患者得到生命救助后发生死亡或残疾,这是医学界的难题。心肺复苏后脑损伤本质为脑缺血再灌注损伤,在这之中,线粒体损伤首当其冲。我们前期研究发现,在CA/CPR大鼠模型,静脉注射细胞外信号调节激酶（Extracellular Regulated protein Kinases,ERK）抑制剂PD98059,能够保护大脑皮质线粒体的结构和功能稳定,抑制线粒体介导的细胞凋亡和自噬。同时发现PD98059能逆转线粒体分裂蛋白动力相关蛋白1（Dynamin Related Protein 1,p-DRP）表达的增加和线粒体融合蛋白2（Mitofusin2,Mfn2）表达的减少,促进线粒体融合/分裂平衡。在缺糖缺氧再灌注（Oxygen-Glucose Deprivation/Resuscitation,OGD/R）细胞模型上,PD98059具有抗氧化作用、抑制细胞凋亡、保护细胞中线粒体的结构和功能稳定作用,但目前PD98059对线粒体融合/分裂相关调节蛋白的影响了解不足。线粒体融合蛋白1（Mitofusin1,Mfn1）是线粒体融合蛋白的关键蛋白之一,位于线粒体双层膜的外层调节线粒体的融合。本实验在前期研究的基础上,在细胞水平缺乏Mfn1表达条件下观察PD98059是否还能抵抗缺糖缺氧再灌注损伤,进一步解释PD98059的神经保护作用及相关机制。方法:通过瞬时转染Mfn1 siRNA,使Mfn1在人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）中低表达,利用蛋白印迹法检测Mfn1 si RNA在SH-SY5Y细胞中Mfn1蛋白表达水平;取转染完成后生长状态良好的SH-SY5Y细胞随机分为6组,正常对照组（Control组）、Mfn1 si RNA组、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）+Mfn1 si RNA组（DMSO+Mfn1 si RNA）、OGD/R+Mfn1si RNA组、OGD/R+Mfn1 si RNA+PD98059低剂量（OGD/R+Mfn1si RNA+PD-L）,OGD/R+Mfn1 si RNA+PD98059高剂量组（OGD/R+Mfn1si RNA+PD-H）。Control组和OGD/R+Mfn1 si RNA组加入完全培养基,DMSO+Mfn1 si RNA组加入含0.04%DMSO的培养基,OGD/R+Mfn1si RNA+PD-L组和OGD/R+Mfn1 si RNA+PD-H组分别加入终浓度为10μmmol/L和20μmol/L PD98059的培养基,作用24小时后,Control组、Mfn1 si RNA组、DMSO+Mfn1 si RNA组加入正常培养基,常规培养,OGD/R+Mfn1 si RNA组、OGD/R+Mfn1 si RNA+PD-L组和OGD/R+Mfn1si RNA+PD-H组的培养板放入无菌密封盒内,持续向密封盒内通入100%的氮气5分钟后密封通气孔,随后放入37℃恒温箱中培养2h,将无糖培养液更换为正常的完全培养基,放入细胞培养箱中继续培养24h。后续实验指标如下:用蛋白免疫印迹法检测转染后Mfn1蛋白的表达情况,确定转染质粒;CCK-8法检测细胞的存活率,确定缺糖缺氧最佳时间;Western blot检测视神经萎缩蛋白（Optic Atrophy protein 1,OPA1）、动力相关蛋白1（Dynamin Related Protein,DRP1）、细胞色素C（Cytochrome c,Cyto c）、活化的胱天蛋白酶3（Claved-caspase3）、Bcl-2和Bax蛋白的表达;酶标法检测培养基中乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase,LDH）活性;采用Hoechst 33258对细胞核进行染色,观察细胞凋亡情况;线粒体的超微结构应用透射电镜来观察;采用紫外分光光度计检测总超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase,T-SOD）和锰超氧化物歧化酶（Mn Superoxide dismutase,Mn SOD）的活性;结果:1.SH-SY5Y细胞转染Mfn1 siRNA-982效率为66.56%,Mfn1蛋白表达量最低。2.Mfn1 si RNA-982转染的SH-SY5Y细胞在不同缺氧时间存活率分别为:Control组（98.15±0.95）、缺氧0.5h（88.60±3.33）、缺氧1.0h（77.71±3.20）、缺氧1.5h（68.26±3.58）、缺氧2.0h（51.77±5.02）、缺氧2.5h（30.16±4.74）、缺氧3.0h（14.36±3.32）。细胞的存活率逐渐降低,随着缺氧时间的延长。3.ERK抑制剂PD98059使Mfn1 siRNA-982转染的SH-SY5Y细胞p-ERK蛋白的表达明显被抑制,ERK的表达量基本保持不变。同时Bcl-2/Bax比值逐渐升高。OGD/R+Mfn1 si RNA组中OPA1、p-DRP1/DRP1以及Cyto c的表达量均增加;在PD98059药物组中,随着药物浓度的增加,这些蛋白的表达量逐渐降低。4.酶标法检测培养基中LDH活性显示OGD/R+Mfn1 siRNA组显著增高,在PD98059药物组中,随着药物浓度的增加,LDH含量逐渐降低。5.Hoechst 33258染色观察到OGD/R+Mfn1 siRNA+PD-L组和OGD/R+Mfn1 si RNA+PD-H组的细胞核形态与OGD/R+Mfn1 si RNA组比较,核染色逐渐变浅,细胞核形态逐渐趋于正常,核固缩减少,核膜损伤减轻。6.透射电镜观察到OGD/R+Mfn1 siRNA组中,线粒体的嵴模糊不清,线粒体肿胀,出现空泡化;OGD/R+Mfn1 si RNA+PD-L组和OGD/R+Mfn1si RNA+PD-H组中,线粒体嵴逐渐清晰,空泡化逐渐减轻,外膜趋于完整。7.紫外分光光度计检测显示OGD/R+Mfn1 siRNA组中T-SOD和Mn SOD的活性较Control组均显著降低;在OGD/R+Si RNA Mfn1+PD-H组中,T-SOD的活性较OGD/R+Mfn1 si RNA组明显升高,Mn SOD的活性随着PD98059剂量的增加逐渐升高。结论:ERK抑制剂PD98059在缺乏Mfn1条件下仍能保护细胞抵抗缺糖缺氧再灌注损伤,保护线粒体形态和功能的完整性,从而减少细胞死亡,提示PD98059的作用对Mfn1的依赖性不强。