牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是一种引起以牛呼吸系统病为主的重要病原微生物,给国内外养殖业造成巨大的经济损失,国内外对牛支原体疫苗的研究还不够成熟,本文在病原分离鉴定以及纯化的基础上建立了M.bovis家兔感染模型,优化了M.bovis的灭活条件,成功制备出了M.bovis灭活疫苗,通过动物实验分析了不同免疫剂量和不同免疫途径对免疫效果的影响,对不同佐剂进行对比,找到合适的免疫佐剂,验证免疫效果。具体研究方法如下：1.将不同浓度梯度的M. bovis分离株以滴鼻的方式感染到家兔呼吸系统,通过比较感染前后家兔的临床、剖检各组织病理变化等以判断是否成功感染,从感染后家兔肺脏、血液中分离出支原体,将培养物纯化后进行PCR检测,进一步亲缘关系分析和血清抗体检测。结果显示：1.0×108ccu/ml的M. bo vis就可使家兔致病,1.0×1010ccu/ml的M.bovis感染到家兔呼吸道之后家兔表现出精神抑郁；剖检后病变主要表现在肺脏,出现水肿、大理石病变等,部分还出现胸腔积液；从肺脏病变组织切片可见肺泡腔出血,肺泡间隙增宽、细支气管上皮黏膜坏死和脱落；用特异性PCR和基因测序的方法对感染后家兔体内分离到的病原进行鉴定,同时检测感染家兔血清中是否出现M.bovis抗体,最终证实M. bovis在家兔体内感染成功。2.用终浓度为0.3%、0.4%、0.5%的甲醛分别对M.bovis培养物进行灭活。为验证灭活效果,将灭活的M.bovis培养物培养并将培养物人工感染实验动物,比较M. bovis培养物免疫前后的免疫原性。结果显示：终浓度为0.5%的甲醛短期内就能将M.bovis彻底灭活,但其免疫原性大大降低,不利于灭活疫苗的制备,终浓度为0.3%的甲醛处理60h后只能将M. bovis部分灭活,终浓度为0.4%的甲醛灭活48h后能将支原体彻底灭活,免疫原性略微降低不影响免疫效果,为最佳灭活条件。3.先将M.bovis液体培养物用终浓度为0.4%的甲醛灭活,其次以用O.lmol/L的PBS洗涤后分别与白油、氢氧化铝、弗氏完全佐剂混合得到5.0×109ccu/ml的M. bovis灭活疫苗,将洗涤后的培养液用生理盐水稀释后得到1.0×1010ccu/ml的灭活疫苗,对疫苗稳定性和无菌性进行检测,最终证实疫苗安全可靠,可以使用。4.将自制的M.bovis灭活疫苗以不同剂量,不同的免疫途径,添加不同佐剂对家兔进行免疫。免疫后通过观察家兔临床表现和注射部位的变化来评价疫苗的安全性,通过监测家兔体内免疫球蛋白(IgG、IgM)、细胞因子IL-4和干扰素IFN-γ、血清抗体水平的变化来筛选最佳的免疫剂量、途径以及合适的佐剂。结果显示：2ml1.0×1010ccu/ml的灭活苗具有很好的保护效果；肌注后免疫效果最佳：将白油佐剂与灭活的M.bovis培养物1：1混合后免疫效果较氢氧化铝和弗氏完全佐剂强。5.为了验证自制M. bovis灭活疫苗的免疫效果。用M.bovis灭活疫苗对家兔免疫后用不同来源的M.bovis培养物进行攻毒,通过对实验家兔进行病理分析,结果显示试验中的灭活疫苗不但对同源支原体具有一定的免疫性,同时也能够阻止异源支原体的再次入侵。