背景和目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方省份及东南亚地区高发的一种起源于鼻咽粘膜的鳞状上皮细胞肿瘤,尤以广东、广西、湖南、福建等地多见。放射治疗是公认的鼻咽癌主要治疗手段。随着放疗技术的不断提高,早期患者的5年总体生存率可高达90%以上。但是,由于鼻咽部比较隐蔽,且早期患者症状不明显,多数患者于就诊时已属中晚期。此外,绝大多数鼻咽癌的病理类型为非角化性未分化型癌,恶性程度较高,具有极强的侵袭能力,极易出现区域淋巴结转移和远处转移,故中晚期患者的平均5年生存率仍然徘徊在70%左右,治疗失败的主要原因包括局部复发(高达24-42%)和远处转移(高达37-48%),而一旦发生转移,患者的中位生存期不超过1年。因此,探究鼻咽癌进展和转移的分子机制,探寻新的干预靶点,对提高鼻咽癌的治愈率和生存率,延长患者生命有着极其重要的临床指导意义。鼻咽癌的发病具有种族易感性、地域集中性和家族聚集倾向,且与EB病毒感染、遗传易感性以及环境因素密切相关,其发生发展是一个多阶段、多步骤、多因素相互作用的复杂过程,涉及多个基因在不同时间和空间上的选择性表达。除了蛋白编码基因,近年研究发现microRNA(亦作miRNA或miR)与鼻咽癌有着密切联系,影响了肿瘤的治疗和预后。microRNA是一种内源性长约22个核苷酸的非编码RNA小分子,其序列在不同物种间具有高度保守性,是调控基因表达的重要分子。microRNA通过碱基互补配对的方式可以与靶基因的3’UTR区域结合,降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译,在转录后水平负性调控靶基因的表达,从而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移,例如,miR-26a在鼻咽癌中低表达,其通过直接靶向EZH2,使细胞阻滞于G1期,从而抑制鼻咽癌细胞的增殖；EB病毒编码的microRNA miR-BART9可直接靶向E-钙粘蛋白,从而促进EB病毒阳性鼻咽癌细胞的侵袭迁移。同时,有文献报道microRNA也可以与靶基因的5’UTR、编码区、启动子区或基因的下游序列相结合,从而促进或抑制靶基因的表达,这些研究表明microRNA的作用方式具有多样性,例如,miR-324-3p在鼻咽癌组织及放疗抵抗的CNE2细胞中低表达,其通过直接靶向作用于WNT2B的5’UTR,从而增加鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。此外,microRNA具有在石蜡标本、外周血及尿液等多种标本中长期存在的稳定性,且血清或血浆中游离的microRNA亦可作为鼻咽癌诊断和预后的分子标志物。由此可见,microRNA在作为肿瘤标志物以及肿瘤治疗靶点方面展示出巨大的潜能,有可能应用于鼻咽癌诊断、分子分型、放化疗疗效预测以及预后判断等方面。miR-744是本课题组在前期研究中基于芯片技术筛选肿瘤相关基因MTA干扰后差异表达microRNA时发现的一个肿瘤相关基因,关于它的功能学研究甚少。Cheah Yoke-Kqueen等曾报道,通过microRNA芯片技术,他们发现miR-744在头颈肿瘤中高表达,表明miR-744在头颈肿瘤中可能是一个促癌基因。然而,miR-744定位于17p12,该区域在侵袭性二倍体乳腺癌、散发胃癌、侵袭性肺小腺癌及原发耐药的霍奇金淋巴瘤中常出现缺失,即miR-744可能是一个抑癌基因。然而,在对小鼠前列腺癌的研究中却得出了与之相反的结论。Vera Huang等曾报道,短期过表达miR-744可诱导Cyclin B1 (Ccnbl)的表达从而促进细胞的增殖,而长期过表达可引起染色体的不稳定性并导致肿瘤抑制。然而,miR-744在鼻咽癌中的表达水平、其表达在鼻咽癌中的临床意义及其在鼻咽癌中的生物学功能,尤其是在肿瘤细胞迁移、侵袭和转移方面,还未曾报道。那么miR-744在鼻咽癌中表达如何,其在鼻咽癌的进展及转移中起着怎样的作用,作用机制又是什么,这一系列问题都需要我们去深入探讨。基于miR-744的研究现状,本课题首先通过荧光定量PCR技术,明确miR-744在鼻咽癌组织及细胞中的表达水平,接着通过miR-744表达失调的体内外功能实验,探讨miR-744在鼻咽癌细胞中的生物学功能,最后通过荧光素酶实验及功能回复实验,阐明miR-744在鼻咽癌中发挥生物学功能的分子机制,为进一步寻找新的鼻咽癌治疗靶点奠定理论基础。材料和方法1.临床标本、细胞系和细胞培养10例鼻咽癌组织和9例正常鼻咽上皮组织均来源于南方医院。44例鼻咽癌组织的cDNA由李欣教授惠赠,其中11例和8例cDNA仅分别用于microRNA和mRNA表达的检测,其余33例既可用于检测microRNA的表达,也可用于检测mRNA的表达。组织标本均经过HE染色组织学检查确认。本研究获得南方医院伦理委员会的批准,所有鼻咽癌患者均签署知情同意书。人鼻咽癌细胞株HONE1、CNE1、 CNE2、C666-1、6-10B和5-8F以及人永生化鼻咽上皮细胞NP-69由南方医科大学肿瘤研究所保存。6种鼻咽癌细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,NP-69细胞培养于KSFM培养基中。所有细胞均于37℃、5%CO2条件下培养。2.稳定转染miR-744前体序列由GeneChem公司合成并插入GV209载体中,构建稳定过表达miR-744的慢病毒载体,名为LV-miR-744。含无关序列的载体为对照。将慢病毒转入5-8F细胞中并经流式细胞仪筛选及qRT-PCR验证后获得稳定过表达miR-744细胞株。3.质粒和寡核苷酸构建及瞬时转染miR-744-inhibitor、nonspecific miR control (anti-NC)、miR-744 mimic和 negative control (mimic-NC)由Genepharma合成。AntagomiR-744、antagoNC、 si-ARHGAP5及其对照购自RiboBio公司。pGL3-ARHGAP5 A/B/C由华安平康公司构建；pGL3-control vector及pRL-TK购自Promega公司。ARHGAP5过表达质粒及其对照购自广州复能公司。瞬时转染按照LipofectamineTM 2000说明书进行操作,转染48小时后进行后续试验。4.RNA抽提及荧光定量PCR从鼻咽癌细胞和组织中抽提总RNA后经逆转录形成cDNA,根据SYBR Green法进行荧光定量PCR,以2-△△Ct表示基因的相对表达水平。5.细胞生物学试验[1]MTT实验：按3×103细胞/孔将转染后的细胞接种至96孔板中,200 μ l/孔,6孔/组,包含空白对照,培养1-4天。将5mg/ml的MTT 20 μ 1分别加入每孔中,37℃培养4h,将孔内培养基轻轻吸弃,加入DMSO 150μl,室温摇床轻摇10min使结晶物溶解充分,于酶标仪上测定490nm波长的吸光度值,用来表示细胞的增殖能力。[2]平板克隆实验：按200细胞/孔将转染后的细胞接种至6孔板中,2m1/孔,充分混匀,培养14天。肉眼可见细胞克隆时终止培养,弃去培养基,经甲醇固定、苏木素染色及蒸馏水清洗后,显微镜下计数克隆数(一个克隆细胞数≥50)。[3]Edu细胞增殖检测：按照Cell-LightTM Edu检测试剂盒说明书操作,将转染后的细胞经Edu孵育、4%多聚甲醛固定、甘氨酸洗脱、Apollo染液染色及PBS清洗后于荧光显微镜下计数Edu阳性细胞数。[4]细胞凋亡检测：按照凋亡检测试剂盒说明书操作,将转染后的细胞经不含EDTA胰酶消化、PBS清洗、Annexin V-FITC及PI染色后于流式细胞仪检测。[5]划痕实验：待细胞转染后融合度为90%时,用20μl加样枪头制造一“十”字样划痕,经PBS清洗、更换无血清培养基后继续培养,并于不同时间点检测细胞的迁移率。[6]迁移和侵袭实验：将转染后的细胞经胰酶消化、PBS清洗及无血清培养基重悬后计数,按1×105细胞/室将细胞加入Transwell小室内,100μl/室,室外浸于新鲜培养基中。待培养12-36h后经棉签擦拭、甲醇固定、苏木素染色及蒸馏水清洗后,于显微镜下计数穿膜生长细胞数。6.裸鼠皮下成瘤实验将稳定过表达miR-744的5-8F/miR-744和对照组5-8F/control分别接种于8只裸鼠的左、右侧后背部皮下,2×106细胞/只,8只/组。第七天开始每三天用游标卡尺分别测量肿瘤的长短径一次,按下述公式计算肿瘤体积：v=(L×W2)/2,其中,L为肿瘤最长径(mm),W为肿瘤最短径(mm)。待实验结束后将裸鼠处死,取出肿瘤组织,经福尔马林固定、酒精脱水、石蜡包埋、切片及HE染色后,光学显微镜观察。7.裸鼠尾静脉肺转移实验将瞬时转染48h后的5-8F/AntagomiR-744和对照组5-8F/AntagoNC分别注射入裸鼠尾静脉中,2×106细胞/只,7只/组。30天后将裸鼠处死,取出肺组织,经福尔马林固定、酒精脱水、石蜡包埋、切片及HE染色后,光学显微镜观察,计算肺转移指数：转移瘤面积/全肺面积。8.双荧光素酶活性检测按照Dual-Luciferase(?) Reporter Assay System说明书操作,将转染后的细胞充分裂解,于GloMaxTM 96 Microplate Luminometer发光仪上分别测定Firefly luciferase和Renilla luciferase的活性,以pRL-TK质粒作为内参,计算上述两荧光素酶活性的比值,比较不同样品间的差异。9. Western blot按照蛋白提取试剂盒说明书操作提取细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度,然后经蛋白变性、电泳、转膜、封闭、免疫杂交、显影后,采用Quantity One软件进行蛋白表达相对定量。10.统计学分析采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析。qRT-PCR各细胞株2-△△ct比较采用Brown-Forsythe法；MTT生长曲线比较采用析因设计的方差分析；体内外功能实验中两组数据之间的比较均采用独立样本t检验。miR-744与ARHGAP5表达的相关性分析采用Spearman目关系数。所有数据均为3次独立重复实验的结果,数值大小以均数±标准误来表示。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.miR-744在鼻咽癌中的表达及其临床意义qRT-PCR结果显示,与NP-69相比,miR-744在6种鼻咽癌细胞株中呈不同程度表达上调(F=22.5320,P=0.0005)；在10例鼻咽癌组织中,miR-744的平均表达水平比9例正常鼻咽上皮组织提高62%(P=0.045)。44例鼻咽癌组织中,miR-744的表达与鼻咽癌的临床分期(t=-3.0501,P=0.0040)、N分期(t=-2.6144,P=0.0124)及T分期(t=-2.3568,P=0.0232)呈正相关。上述实验结果表明,miR-744在鼻咽癌组织和细胞中表达上调,且与鼻咽癌的疾病进展呈正相关,表明miR-744可能是一个促癌基因,为其生物学功能研究提供了初步依据。2.miR-744在鼻咽癌细胞中的生物学功能研究选取人鼻咽癌细胞株SUNE-1的高转移亚株5-8F及低分化鼻咽癌细胞株HONE1作为细胞模型,通过miR-744表达失调的体内外功能实验,研究miR-744在鼻咽癌细胞中的生物学功能。首先,瞬时转染miR-744 mimic和inhibitor, qRT-PCR检测miR-744的表达变化,结果发现,在5-8F及HONE1中转染miR-744mimic后,miR-744的表达分别提高了440倍(t=-41.5763,P=0.0000)和282倍(t=14.2170,P=0.0000)；而转染miR-744 inhibitor后,miR-744的表达分别降低74%(t=-35.5825,P=0.0001)和95%(t=115.6971,P=0.0000)。该结果表示,瞬时转染miR-744 mimic和inhibit or后可显著上调或下调miR-744的表达。其次,通过划痕实验和Transwell迁移及侵袭实验观察miR-744表达改变对鼻咽癌细胞侵袭迁移能力的影响。划痕实验结果发现,转染miR-744 mimic后,5-8F及HONE1的迁移率分别提高了1.46倍(t=-6.0498,P=0.0038)和1.65倍(t=6.9631,P=0.0001)；而转染miR-744 inhibitor后,两种细胞的迁移率分别降低了36%(t=-13.9914,P=0.0022)和31%(t=4.1427,P=0.0143)。Transwell迁移及侵袭实验结果发现,miR-744过表达使5-8F及HONE1的迁移细胞数分别提高了2.48倍(t=-21.2596,P=0.0000)和2.27倍(t==7.1178,P=0.0021),侵袭细胞数分别提高了3.14倍(t=-21.0958,P=0.0000)和2.43倍(t=-9.2698,P=0.0008)；而miR-744低表达使两种细胞的迁移细胞数分别降低了58%(t=6.2225,P=0.0034)和77%(t=5.8897,P=0.0042),侵袭细胞数分别降低了59%(t=5.9699,P=0.0040)和64%(t=3.5335,P=0.0242)。在此结果基础上,构建持续干扰miR-744的细胞株5-8F/AntagomiR-744及5-8F/AntagoNC,经过qRT-PCR检测发现,AntagomiR-744可持续干扰miR-744使其表达降低超过50%至少15天,遂将5-8F/AntagomiR-744及5-8F/AntagoNC分别注射入裸鼠尾静脉中,建立裸鼠尾静脉注射肺转移模型,进一步研究干扰miR-744对鼻咽癌细胞体内转移能力的影响。结果表明,对照组肺转移瘤大且数量较多,而实验组肺转移瘤小且数量较少,与对照组相比,实验组的肺转移指数明显降低81%(t=2.7938,P=0.0296)。最后,通过MTT实验、平板克隆形成实验、Edu细胞增殖检测及细胞凋亡实验观察miR-744表达改变对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。MTT结果显示,转染miR-744 mimic后,5-8F和HONE1细胞生长加快(P=0.0000,0.0000)；而转染miR-744 inhibitor后,两种细胞生长速度减慢(P=0.0009,0.0008)。平板克隆形成实验显示,miR-744过表达使5-8F和HONEl的克隆形成率分别提高了1.47倍(t=-9.7502,P=0.0006)和1.61倍(t=5.1920,P=0.0066)；而miR-744低表达使两种细胞的克隆形成率分别降低了34%(t=7.9394,P=0.0014)和26%(t=-10.3020,P=0.0005)。Edu细胞增殖检测结果显示,转染miR-744 mimic后,5-8F和HONE1中Edu阳性细胞率分别提高了1.24倍(t=-3.9000,P--0.0175)和1.50倍(t=-4.7213,P=0.0092)；而转染miR-744 inhibitor后,两种细胞中阳性细胞率分别降低了30%(t=4.2548,P=0.0131)和46%(t=5.9850,P=0.0039)。细胞凋亡实验显示,miR-744过表达使5-8F和HONE1的细胞凋亡率分别降低了24%(t=3.5496,P=0.0238)和40%(t=4.4922,P=0.0109)；而miR-744低表达使两种细胞的细胞凋亡率分别提高了1.20倍(t=-5.0289,P=0.0073)和1.54倍(t=-3.1292,P=0.0352)。在此结果基础上,将慢病毒转入5-8F细胞中构建稳定过表达miR-744的细胞株5-8F/miR-744及5-8F/control,经过qRT-PCR检测发现,miR-744的表达提高了3.32倍(t=33.9602,P=0.0000)。遂将5-8F/miR-744及5-8F/control接种至裸鼠皮下,建立裸鼠皮下成瘤模型,进一步研究miR-744过表达对鼻咽癌细胞体内成瘤能力的影响。结果表明,接种后第10天成瘤能力开始出现差异,5-8F/miR-744细胞所形成的肿瘤体积显著大于对照细胞(t=2.4996,P=0.0383)。至第21天,5-8F/miR-744细胞所形成的肿瘤体积较对照细胞增大2.64倍(t=5.9742,P=0.0000),且肿瘤的平均重量亦较对照细胞提高了3.96倍(t=39.1682,P=0.0000)。以上结果显示,miR-744参与了鼻咽癌的进展及转移过程,其表达失调与鼻咽癌细胞的体内外增殖及转移密切相关,在鼻咽癌中起着促癌基因的作用。3.miR-744促进鼻咽癌细胞侵袭迁移的相关分子机制研究目前,ARHGAP5已被证实能促进多种肿瘤细胞的增殖及侵袭迁移。通过qRT-PCR及Western blot检测miR-744过表达或抑制后的鼻咽癌细胞株5-8F及HONE1中ARHGAP5 mRNA和蛋白的表达我们发现,miR-744过表达后可显著上调鼻咽癌细胞株中ARHGAP5 mRNA和蛋白的表达,而抑制miR-744后ARHGAP5 mRNA和蛋白的表达降低。利用TargetScan、miRanda和RNAhybrid三大软件对miR-744进行靶基因预测,结果发现,在TargetScan和miRanda两大数据库中并未发现miR-744靶向ARHGAP5 3’UTR的结合位点,而利用RNAhybrid我们发现miR-744在ARHGAP5的启动子区存在2个可能结合位点(site 1,-508至-484；site 2,-200至-176,其中,miR-744的种子序列在site 1中与ARHGAP5连续完全互补配对)。基于以上结果我们推测,ARHGAP5可能是miR-744的靶基因。因此,我们将含有miR-744结合位点的ARHGAP5的启动子区克隆到报告基因载体pGL3中,分别构建了3个载体：ARHGAP5 A(-1006至+238)和ARHGAP5 B(-534至+238)均包含两个结合位点,ARHGAP5 C(-431至+238)只包含site 2。将上述质粒和miR-744 mimic、negative control及海肾荧光素酶载体pRL-TK共转染5-8F及HONE1细胞,检测荧光素酶活性,结果发现,与对照组相比,miR-744 mimic可分别使5-8F及HONE1细胞中pGL3-ARHGAP5 A的荧光素酶活性提高1.78倍(t=10.8158,P=0.0004)和1.82倍(t-=6.9733,P=0.0022),pGL3-ARHGAP5 B的荧光素酶活性提高2.04倍(t-=18.1219,P=0.0000)和1.81倍(t=16.4906,P=0.0000),但pGL3-ARHGAP5 A与pGL3-ARHGAP5 B的荧光素酶活性无统计学差异,而miR-744 mimic对 pGL-ARHGAP5 C的荧光素酶活性无明显改变。表明miR-744与ARHGAP5的site 1可特异性结合。基于以上结果,我们分别将si-ARHGAP5及其对照与miR-744 mimic及negative control进行共转染,通过荧光定量PCR及Western blot检测,我们发现,与对照组相比,过表达miR-744能提高ARHGAP5的表达,抑制ARHGAP5能显著降低其自身的表达,而共转染si-ARHGAP5及miR-744 mimic后,miR-744mimic可部分或完全逆转si-ARHGAP5对ARHGAP5表达的影响。此外,我们还进行了Transwell迁移实验和Boyden侵袭实验,进一步从功能实验证实miR-744对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的调控是通过ARHGAP5实现的。最后,我们分别将ARHGAP5过表达质粒及其对照与miR-744 inhibitor及nonspecific miR control共转染并进行上述实验,结果与上述结论相符。然而,通过MTT实验我们并未发现ARHGAP5对miR-744介导的鼻咽癌细胞增殖的影响。4.ARHGAP5在鼻咽癌中的表达及其临床意义通过qRT-PCR及Western blot检测我们发现,与NP-69相比,URHGAP5的mRNA及蛋白在除C666-1之外的5种鼻咽癌细胞株中呈不同程度表达上调(F=294.2476,P=0.0000),尽管miR-744与ARHGAP5 mRNA的表达呈正相关,但相关性无统计学意义(r=0.7714,P=0.0724)。通过荧光定量PCR检测41例鼻咽癌组织中ARHGAP5的表达我们发现,ARHGAP5的表达与鼻咽癌临床分期及N分期呈正相关(分别为t=-2.4464,P=0.0192；t=-2.4045,P=0.0216),与T分期无显著相关性(t==-1.0882,P=0.2873)。此外,我们将33例鼻咽癌组织中miR-744的表达与ARHGAP5的表达进行相关性分析,结果显示两者的表达呈正相关,且相关性具有统计学意义(r=0.3506,P=0.0455)。结论1.miR-744在鼻咽癌组织和细胞株中表达上调,且与鼻咽癌的临床分期、N分期、T分期呈正相关。2.miR-744参与了鼻咽癌的进展及转移机制,其表达失调可影响鼻咽癌细胞的体内外增殖和转移能力,扮演着癌基因的角色。3.在鼻咽癌中,ARHGAP5为miR-744的靶基因,miR-744通过直接靶向ARHGAP5启动子促进其转录从而促进鼻咽癌细胞迁移和侵袭。4. ARHGAP5在鼻咽癌细胞株中表达上调,且与鼻咽癌的临床分期、N分期呈正相关。