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目的: 用人蛔虫体腔液(Ascaris body fluid,简称ABF)体外诱导人肺上皮细胞株(A549),观察其是否能够诱导靶细胞凋亡及凋亡与ABF浓度和作用时间的相互关系;运用RT-PCR方法检测靶细胞诱导过程中bcl-2/bax基因的表达变化,探讨其凋亡与基因表达的相互关系。 方法: 1.标本采集:对新建县昌邑小学学生进行驱虫治疗,一次口服双羟萘酸噻嘧啶(30mg/Kg体重),服药后24小时从粪便中收集人蛔虫成虫。 2.ABF的制备:取完整的蛔虫,经自来水、无菌生理盐水洗净后,滤纸吸干,持镊子夹住前端,使之垂直于消毒离心管上,在虫体末端剪一小口,体液自然流出,逐条收集。收集的液体在10,000×g离心30分钟,取上清,经0.45μm醋酸纤维膜过滤除菌,用核酸蛋白仪测蛋白含量为3370μg/ml,置-30℃储藏备用。 3.细胞凋亡测定(HE染色):根据MTT法细胞毒性实验结果,确定细胞存活率大于50%的ABF浓度作为实验范围,设定ABF浓度分别为300μg/ml、100μg/ml、30μg/ml、10μg/ml和3μg/ml五个浓度组,诱导人肺上皮细胞株,分别在诱导后的第1、3、5、7、9小时,采用HE染色计数,测定细胞凋亡率。 4.DNA提取及琼脂糖凝胶电泳:对ABF浓度为100μg/ml、诱导时间为5小时的样本,采用酚抽提法提取DNA。用提取的DNA样本做琼脂糖凝胶电泳,在2%琼脂糖凝胶中,电压为5V/cm电泳2小时,在紫外灯下观察条带图谱。 5.RT-PCR:选用ABF浓度分别为100μg/ml、10μg/ml和3μg/ml的三个实验组诱导细胞,用总RNA提取试剂盒(PROMEGA TM048),分别在诱导