论文部分内容阅读
背景和目的系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种可累及多个脏器组织的自身免疫性疾病,吞噬功能障碍使得凋亡细胞不能及时被清除以致大量自身抗原释放诱发自身免疫被认为是疾病启动的重要环节,CD4+CD25highFoxP3+调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs),作为维持T细胞稳态和免疫耐受的关键性调节组分,在SLE患者中存在数量和／或质量上的缺陷,参与了SLE疾病的发生发展。CD200是Ⅰ型跨膜糖蛋白,可调节免疫应答阈值和细胞因子产生极向,参与免疫稳态的维持。本研究旨在评估系统性红斑狼疮(SLE)患者中CD200/CD200R1的表达和功能状态。诸多证据显示CD200/CD200R1在实验性自身免疫性疾病中具有重要作用,这一信号通路在人类的自身免疫性疾病如SL,E中的作用仍不明确,本研究旨在探讨SLE患者中CD200/CD200R1信号的表达和功能异常。研究方法明确诊断为SLE的初治患者161人,同期选取年龄性别匹配的健康对照95人,采集抗凝外周静脉血无菌分离单个核细胞。流式细胞仪检测各细胞亚群表面CD200和CD200R1的表达。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清游离CD200水平。Western Blot检测CD4+T田胞中DOK2表达和p-DOK2的水平。通过体外细胞培养观察CD200信号对Th17细胞分化及调节性T细胞(Treg)生成的影响。CFSE染色测定CD200信号对体外刺激培养细胞增殖的影响。Annexin V/propidium iodide染色测定CD200对细胞凋亡的影响。通过流式细胞术分选出CD200+的活细胞,CD200-的活细胞,CD200+的早期凋亡细胞,CD200-的早期凋亡细胞,并将这几组细胞与体外诱导的树突状细胞共孵育。通过荧光显微镜及流式细胞术分析树突状细胞与各组细胞的结合及吞噬情况。通过transwell迁移分析测定游离CD200对树突细胞趋化的影响。结果1.SLE患者PBMC中CD200+细胞比例显著高于健康对照(p=0.026),尤以CD4+T细胞(p=0.012)、CD11c-CD123high浆样树突细胞(pDC)(p=0.004)和CDl1c+CD123+髓样树突细胞(mDC)(p=0.016)为著,而CD8+T细胞、CD19+B细胞、CD38high浆细胞及CD14+单核细胞无此趋势(p>0.05)。2.CD3+CD200+细胞比例与血清C3水平负相关(r=-0.486,p<0.05)。3.SLE患者血清中CD200水平也显著高于健康对照(p<0.0001),且血清CD200的水平与血清C3水平负相关(r=-0.45,p=0.014),但与SLEDAI评分、血清中BAFFIL-6、IFN-a、anti-dsDNA不相关(p>0.05)。4.SLE患者PBMC中CD200R1+细胞比例显著低于健康对照(p=0.001),尤以CD4+T细胞(p=0.004)、pDC(p<0.001)和mDC(p<0.001)中为著。不论是在SLE患者还是在健康对照,CD4+CD45RA+纯真T细胞中CD200R1的表达均显著低于CD4+CD45R0+记忆T细胞(p<0.05),而SLE患者与健康对照之间并无差异。5.CD200Fc可诱导CD4+T细胞DOK2磷酸化。6.抗CD200R1抗体可促进TCR活化驱动的SLE患者CD4+T细胞增殖。7.CD200信号减少CD4+T细胞向Thl7细胞分化。8.CD200信号可纠正SLE患者CD4+CD25hi"hFoxP3+Treg细胞的生成缺陷。9.SLE患者凋亡淋巴细胞增加并伴有CD200上调。10.早期凋亡细胞中CD200的表达与DC结合吞噬能力下降有关。11.CD200Fc抑制DC迁移。结论我们证实在SLE患者中CD200+细胞和血清CD200水平显著增高,而CD200R1水平显著下降,以CD4+T细胞和DCs尤为显著。SLE患者中,CD200Fc可减少Thl7细胞比例并纠正CD4+CD25highFoxP3+Treg的诱导缺陷。而抗CD200R1抗体可促进抗CD3/抗CD28刺激的CD4+T细胞增殖。此外,我们发现SLE患者早期凋亡细胞的CD200表达上调并可抑制DCs对其结合和吞噬的能力。以上数据说明SLE患者存在CD200和CD200R1的表达和功能异常,并参与了其免疫紊乱的发生。背景和目的系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多系统受累的自身免疫性疾病,B细胞的异常增殖活化是SLE的特征之一。小RNA (microRNAs, miRNAs)是近年来发现的一类单链非编码小RNA,成熟mi RNA能够在转录后水平抑制靶mRNA表达,miRNAs在进化中高度保守。近年多项研究证明,miRNAs参与生物体的生长、发育、衰老、凋亡的调控及遗传背景的稳定,并与人类疾病相关。在本实验室的前期工作中初步发现SLE的发病与mir-7的异常表达相关。目前对mir-7的研究主要在肿瘤方面,然而,mir-7在自身免疫病特别是SLE的发病中的作用尚无研究。本研究就mir-7在SLE患者中的表达及功能进行了探讨。研究方法明确诊断为SLE的初治患者20人,同期选取年龄性别匹配的健康对照20人,采集抗凝外周静脉血无菌分离单个核细胞。荧光定量PCR法(Taqman探针法)检测SLE患者及HC外周血中PBMC、B细胞、T细胞、单核细胞中mir-7的表达。应用生物信息学方法及双荧光素酶报告基因系统预测并验证mir-7的靶基因。利用流式细胞或者磁珠从外周血PBMC中分选出B细胞、T细胞、单核细胞。荧光定量PCR法(染料法)检测SLE患者及HC外周血中B细胞、T细胞中类脂磷酸酶PTEN (phosphatase and tensin homologdeleted onchromosome ten)的mRNA水平。通过电转染分别转染pre-mir-7、anti-mir-7或control-microrna到3组外周血B细胞,使B细胞中mir-7过表达或抑制表达后,荧光定量PCR法(染料法)检测PTEN的mRNA水平,CFSE染色转染后的B细胞,刺激培养5天后检测B细胞的增殖功能。通过腺病毒转染Ad-mir-7及对照Ad-GFP到外周血PBMC,48小时后流式细胞仪检测CD200R1蛋白的表达水平。结果1.检测初治SLE患者和正常对照PBMC中mir-7的表达,发现SLE患者mir-7的表达显著高于HC,具有统计学差异(0.86±0.03vs0.10±0.08,p=0.0001)。SLE患者B细胞中mir-7的表达显著高于HC,具有统计学差异(0.59±0.08vs0.31±0.06,p=0.027),然而SLE患者T细胞及单核细胞中mir-7的表达与HC无统计学差异(0.91±0.18vs0.99±0.18,p=0.78,1.30±0.36vs0.98±0.02,p=0.70),所以miR-7表达量的差异主要集中在B细。2.通过生物信息学方法预测miR-7的靶基因,挑选与SLE发病可能相关的8个靶基因(PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB),采用双荧光素酶报告基因系统验证,各组荧光素酶活性均下降(P<005),说明miR-7可以通过与PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB的3’UTR区相互作用发挥功能3.比较初治SSLE患者及HC的T、B细胞中PTEN mRNA的表达,发现在SLE患者B细胞中表达较HC下调,具有统计学差异(0.92±0.24vs2.20±0.49,p=0.041),在T细胞中的表达与HC相比无明显差异(1.23±0.24vs1.55±0.53,p=0.579)。4.通过电转染的方法,分别转染pre-mir-7、anti-mir-7、control microrna至外周血B细胞中,结果显示该方法能够在B细胞中有效过表达或抑制表达mir-7。5.在B细胞中过表达或抑制表达mir-7后,PTEN的mRNA水平相应下调或上调,B细胞增殖功能相应增强或减弱,说明在人的B细胞中,mir-7能够直接抑制PTEN的表达水平,并能够促进B细胞增殖。6.在PBMC中转染Ad-mir-7或Ad-GFP,结果显示转染Ad-GFP48小时后CD200R1的阳性率为25.13%,平均荧光强度MFI=406.55,转染Ad-mir-748小时后CD200R1的阳性率为7.51%,平均荧光强度MFI=262.86,说明mir-7能够直接下调CD200R1的表达水平。结论SLE患者外周血PBMC中mir-7的表达较健康对照上调,主要集中在B细胞中,并且在SLE患者外周血B细胞中,PTEN mRNA的表达较健康对照减少,通过生物信息学预测方法、双荧光素酶报告基因系统验证方法以及体外直接转染的方法,均证明PTEN是mir-7的靶基因,在B细胞中过表达或抑制表达mir-7后,PTEN的mRNA水平相应下调或上调,并且发现B细胞增殖功能相应增强或减弱,可以推测mir-7可能通过调控PTEN基因的表达来影响B细胞的增殖功能,从而参与SLE的发病。另一方面,我们证明CD200R1也是mir-7的靶基因,CD200/CD200R1信号通路在SLE的发病中的作用已在第一部分详述,可以推测mir-7还可能通过调控CD200R1的水平参与SLE发病。