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猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种以猪为唯一自然宿主的急性动物传染病。PRV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科成员。PRV感染仔猪可引起从温和的亚临床症状到死亡等不同程度临床症状。PRV能够通过感染上皮细胞侵入宿主的外周神经系统,并在外周感觉神经元建立长期的潜伏感染,这些潜伏感染的病毒在适当的环境或刺激下被再次激活,并装配成具有感染性的病毒粒子。PRV UL56蛋白(pUL56)的功能首次报道于2016年。研究发现PRV UL56基因与病毒在神经系统中的传播能力相关。为研究PRV pUL56功能及其与宿主互作机制,本课题首先确定了 pUL56亚细胞定位及分子机制。研究表明pUL56通过其C末端跨膜域定位于细胞中的高尔基体和跨高尔基网络。我们发现174脯氨酸(P)、181亮氨酸(L)、185L和191L是蛋白核周定位的关键氨基酸。进一步,我们基于L对C末端进行定点丙氨酸突变。最终,我们确定了 pUL56最小突变体“174P/A-177L/A-181L/A-185L/A-191L/A-194L/A-195I/A-196-197L/A-200L/A”完全失去高尔基体-TGN定位能力。Bcl2相关永生基因3(BAG3)在多种病毒裂解性感染周期中发挥重要作用。但是,BAG3在PRV感染过程中的作用还未知。本研究首先利用免疫共沉淀实验和共定位分析确定了 PRV pUL56与BAG3存在生理上的互作。研究结果表明pUL56通过四个PPxY基序与BAG3产生互作。进一步研究发现过表达pUL56对HEK293T细胞内源性BAG3及共转染体系中质粒表达的BAG3蛋白均产生显著的下调。本研究首先验证PRV pUL56是否通过其PPxY基序下调BAG3。利用PPxY/AAxY突变体和PPxY域截短体进行验证发现PPxY基序在BAG3降解过程中没有起到作用。为进一步确定pUL56介导BAG3下调的分子机制,我们首先确定了 pUL56 C末端为介导BAG3降解的关键区域。基于我们对pUL56 C末端在亚细胞定位的研究基础,利用13个pUL56 C末端跨膜域突变体确定了第181和185位亮氨酸(L)为pUL56介导BAG3降解的关键氨基酸。PRV pUL56突变体181L/A-185L/A不再降解BAG3。并且,这种降解的发生依赖于pUL56的高尔基体定位及溶酶体降解通路。进一步,我们利用CRISPR/Cas9技术构建了UL56基因缺失(△UL56)突变毒株。利用野生型(WT)和ΔUL56PRV感染多个不同种属来源的细胞系以研究pUL56在病毒裂解性感染细胞过程中对内源性BAG3的调控。研究结果显示两种病毒均未对细胞内源性BAG3产生显著的调控作用。但是,PRV感染可导致种属特异性的BAG3裂解发生。使用过表达试验和敲低试验研究BAG3在PRV裂解性感染过程中的作用。试验结果显示过表达BAG3可显著抑制病毒gB蛋白水平,并降低感染细胞中的病毒滴度。相反,BAG3敲低可显著提高病毒gB蛋白水平,并增加感染细胞中的病毒滴度。因此,BAG3在PRV裂解性感染细胞过程中起到负调控作用。综上所述,本研究结果揭示了 1种新的pUL56介导宿主蛋白降解分子机制,并阐明了 pUL56亚细胞定位及分子机制。此外,该研究也阐明了细胞BAG3在PRV裂解性感染过程中的调控作用。为PRV pUL56神经毒力分子机制的研究奠定了基础。