何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根,具有补肝肾、益精血、乌须发之功效,是历代医家广为推崇的补益药和抗衰老药,临床应用非常广泛。其化学成分主要为二苯乙烯苷类、蒽醌类、蒽酮类等。近年来何首乌导致肝毒性问题逐渐凸显,虽然针对此问题研究广泛,但何首乌致肝毒性作用机制及毒性物质尚存争议。本研究从何首乌致肝毒性的临床特点出发,即长期口服含何首乌制剂后出现胆红素异常升高,并伴有黄疸等症状,且停药后多数患者自行恢复;由于UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）酶为胆红素唯一代谢酶,可将胆红素代谢为胆红素葡萄糖醛酸结合物,经胆汁排泄,完成解毒过程。因此本研究以胆红素体内代谢环节为切入点,提出:“何首乌致肝毒性作用机制可能为抑制了 UGT1A1介导的胆红素代谢”的科学假说。拟通过体外（肝微粒体）实验,首先系统考察何首乌及单体成分对UGT1A1酶的影响,初步推测其可能的肝毒性机制及潜在毒性成分;其次,采用2D,3D细胞从人源层面证实待测物的肝毒性作用;在体外实验的基础上选择抑制作用明确的单体成分及70%何首乌醇提物进行大鼠体内毒性实验,进一步验证课题假说;最后,采用计算机分子对接手段,从蛋白结构及分子结构角度出发,明确单体成分与UGT1A1酶的作用靶点,作用强弱,以期综合阐释何首乌致肝毒性作用机制,及毒性物质。本论文主要包括以下几方面的内容:一、采用肝微粒体体外方法考察何首乌原型及代谢产物对UGT1A1酶的抑制作用建立不同种属体外肝微粒体孵育体系,并最终确定筛选模型为大鼠肝微粒体。分类考察何首乌提取物及单体成分（二苯乙烯苷、蒽醌类、蒽酮类）对UGT1A1酶的影响（以Ki为评价指标）用以推测其潜在肝毒性作用;启动Ⅱ相代谢反应,考察原型成分对酶的直接作用;启动Ⅰ、Ⅱ相代谢,考察原型及其代谢物对UGT1A1酶的影响,观察抑制作用的变化;启动Ⅰ相代谢,将抑制作用的变化与Ⅰ相代谢产物相联系,推测其潜在肝毒性。结果表明:（1）二苯乙烯苷类成分对UGT1A1介导的胆红素代谢环节无明显抑制作用。（2）蒽醌类成分:大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷无论以原型形式或代谢物形式存在,均对UGT1A1酶产生强抑制作用。而大黄素甲醚只有经过Ⅰ、Ⅱ相代谢后生成大量大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷,才具有潜在肝毒性风险。（3）单蒽酮类成分:大黄素型单蒽酮无论原型或其代谢产物均有强抑制作用,其代谢产物为大黄素-大黄素型二蒽酮、二蒽酮糖苷及同样具有强抑制作用的cis-emodin dianthrones。因此推测大黄素型单蒽酮为何首乌中重要的潜在致肝毒性成分。（4）二蒽酮类成分:polygonumnolide C2和trans-emodin dianthrones无论原型成分或其代谢产物均有强抑制作用;Polygonumnolide Cl、polygonumnolide C3、polygonumnolide C4经由两相代谢后抑制作用明显增强,分析代谢产物发现,polygonumnolide C1,C3 代谢为 Polygonumnolide C2;而 polygonumnolide C4代谢为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷,提示存在肝毒性风险。（5）70%（制）何首乌醇提物:70%何首乌醇提物经由两相代谢后抑制作用减弱,分析原因与其中含量较高的大黄素、大黄酚和羟基大黄素经两相代谢后抑制作用减弱相关;而70%制何首乌醇提物经由两相代谢后,由弱抑制变为无抑制作用,证明经加工炮制后的何首乌具有较小的肝毒性风险。通过体外肝微粒体实验初步证实了何首乌及相关单体成分可对UGT1A1介导的胆红素代谢产生抑制作用,存在引发胆红素代谢异常,导致肝毒性的风险。二、利用人体外3D肝脏模型研究何首乌及单体成分对人肝细胞的影响在体外肝微粒体实验的基础上,选取抑制作用明显的70%何首乌醇提物及单体成分（大黄素型单蒽酮、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸、大黄素甲醚）,采用体外方法,应用2D肝细胞单次给药及3D多细胞聚球体培养重复多次给药,对待测物进行肝毒性作用评价,所得结果均呈现明显的毒性剂量依存关系,在人源层面证实其存在致肝毒性作用。三、通过大鼠体内实验考察何首乌及单体成分的的肝毒性作用在体外实验的基础上,大鼠口服给药抑制作用及肝细胞毒性明显的70%何首乌醇提物及单体大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素型单蒽酮、大黄素甲醚,结果发现:（1）生理病理层面:大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷可诱导轻度肝细胞/枯否氏细胞空泡变性伴出血;大黄素甲醚给药后可见中度肝细胞变性坏死,大黄素型单蒽酮可导致大鼠肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）显著降低,提示三个单体成分,在体内存在一定的致肝毒性风险。（2）体内UGT1A1酶活性影响:70%何首乌醇提物及单体成分给药后,四个待测物均可对UGT1A1酶产生较显著的抑制作用,使其与底物的亲和能力降低,清除率降低。体内实验结果与体外实验相一致,进一步为假说“何首乌可能通过抑制介导胆红素代谢的UGT1A1酶活性致肝毒”提供数据支撑。（3）毒代动力学特征:三个单体给药后在大鼠体内AUCall浓度均较高,推测大量高浓度的单体成分以原型形式在大鼠体内存在,存在致肝毒性风险。（4）基因层面:大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷口服给药后,抑制UGT1A1酶表达,同时下调摄取转运体Oatp1a1,上调外排转运体MRP2,提示存在引发胆红素原型堆积的风险,推测其具有潜在肝毒性。大黄素甲醚及大黄素型单蒽酮并未观察到胆红素直接代谢酶UGT1A1的基因表达明显改变,仅转运体发生相应上调或下调,提示可增加给药周期进一步进行研究。体内毒性实验结果与前期体外抑制结果基本一致,从另一侧面验证何首乌致肝毒性假说“何首乌可能通过抑制介导胆红素代谢的UGT1A1酶活性致肝毒”,同时进一步推测了潜在肝毒性物质。四、分子对接技术探索何首乌化学成分与UGT1A1酶相互作用首先,以何首乌潜在肝毒性成分的化学结构为出发点,结合前期体外酶抑制作用结果（Ki）进行构效关系分析。初步发现:大黄素型蒽醌类化合物,当母核上-OH或葡萄糖分子增多后,其抑制作用明显增强;同时,二蒽酮及其糖苷类化合物,10和10’位H的构型以及引入的葡萄糖分子都会影响母核上-OH的暴露程度,继而影响其抑制作用。因此初步推测,-OH及葡萄糖分子有利于分子与酶的结合。其次,通过分子对接手段进一步探索单体成分与UGT1A1酶的相互作用,将单体成分与UGT1A1蛋白对接,明确结合靶点,同时根据复合物结合自由能推测二者亲和能力。结果表明:在UGT1A1酶蛋白的9个活性区中,具有竞争型抑制作用的单体成分与UGT1A1酶的底物胆红素对接进入相同活性区sit F;而具有其它抑制类型的化合物对接进入另一活性区,site C;作用靶点得以阐明。同时,对接模式显示疏水作用是单体成分与UGT1A1蛋白结合的主要作用,因此特定的母核结构有利于其与酶结合;同时,是否具有能与氨基酸残基产生氢键结合的官能团如-OH和额外的葡萄糖分子也影响其与UGT1A1酶的亲和作用。然而,随着分子结构增大,刚性增强（如二蒽酮糖苷）,当分子直径与活性口袋直径相当或大于口袋直径时,10或10’位H键的构型将影响整个分子的空间构型,继而影响其在口袋的停靠位置,降低其与酶蛋白间的疏水作用。由结合自由能初步推测其与UGT1A1的亲和作用强弱为,site F区:trans-emodin dianthrones（-42.4254 kcal·mol-1）>cis-emodin dianthrones（-39.8091 kcal·mol-1）>大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（-34.7005 kcal·mol-1）>羟基大黄素（-29.6367 kcal·mol-1）>大黄素（-25.9932 kcal·mol-1）>大黄素型单蒽酮（-23.4174 kcal·mol-1）>大黄酚（-18.3957 kcal·mol-1）。SiteC 区:polygonumnolides C1（-43.0276 kcal·mol-1）>polygonumnolides C2（-36.9558 kcal·mol-1）>polygonumnolides C3（-37.2953 kcal·mol-1）>polygonumnolides C4（-31.1608 kcal·mol-1）>大黄酸（-20.6433 kcal·mol-1）>大黄素甲醚（-19.7442 kcal·mol-1）。综上所述,本研究通过体外、体内实验及分子对接等手段,初步证实70%何首乌醇提物、其主要单体成分及其代谢产物对UGT1A1酶存在抑制作用,存在引发胆红素原型堆积,继而产生肝毒性作用的风险;同时从酶蛋白结构出发,进一步明确了待测物与UGT1A1的作用靶点,以及相互作用强弱。最终,综合体内、外实验结果,初步推测并阐述了何首乌致肝毒性的作用机制可能为抑制UGT1A1介导的胆红素代谢,并推测潜在毒性物质为二蒽酮类:trans-emodin dianthrones、cis-emodin dianthrones;二蒽酮糖苷类:polygonumnolides C1-4;单蒽酮类:大黄素型单蒽酮;蒽醌类:大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷及大黄素甲醚。本研究所建立的肝毒性评价方法为毒性中药体内、外研究提供了新的思路,同时也是建立肝毒性中药的研究体系的重要探索。