鱼类生长主要依赖于肠道对营养物质的消化和吸收。本试验首先通过生长试验研究了赖氨酸对生长中期草鱼(Ctenopharyngodonidellus)生长性能和消化器官生长发育、消化酶和刷状缘酶活力及基因表达水平的影响;其次,通过生长试验研究对生长中期草鱼肠道抗菌肽、细胞因子及TLR/NFκB信号分子表达的影响,探索了赖氨酸对鱼类肠道免疫屏障的作用;同时进一步通过细胞试验考察草鱼肠上皮细胞细胞因子和相关信号分子的表达,探索赖氨酸对鱼类肠道上皮细胞细胞因子表达的影响及其可能作用机制。第三,通过体内体外试验考察赖氨酸对草鱼肠上皮跨膜电阻和通透性、肠道紧密连接、MLCK和PKC信号分子基因表达的影响,探索赖氨酸对鱼类肠道物理屏障的影响及其可能机制;第四,通过动物试验考察草鱼肠道GSH含量和抗氧化酶活力及Nrf2信号途径相关信号分子基因表达水平,探索赖氨酸对鱼类肠道结构完整性的影响及其作用机制,并在动物试验的基础上,通过草鱼肠道上皮细胞(IECs)氧化应激模型,研究了赖氨酸对鱼类肠上皮细胞氧化损伤的预防、阻截和修复作用,探索了赖氨酸促进鱼类肠道抗氧化损伤的作用方式。主要研究内容和结果如下:1.赖氨酸对草鱼生长性能和消化吸收能力的影响选择体重相近(254.9 ±1.1 g)的健康草鱼720尾进行为期56天的生长实验,考察不同添加水平的赖氨酸对中期草鱼生长性能以及消化吸收能力的影响。实验设计6个处理,每个处理设4个重复,每个重复30尾鱼。每个处理饲喂含不同水平的赖氨酸(7.1、9.6、12.2、14.6、17.0和19.6 g/kg)的半纯合饲粮。结果发现,添加适宜水平的赖氨酸可以提高草鱼的特异性生长率(SGR)、采食量(FI),降低饲料转化率(FCR)(P<0.05)。同时本研究还发现,适宜水平的赖氨酸可以提高草鱼肝胰脏和肠道的重量、肠体指数、肠道胰蛋白酶、脂肪酶、糜蛋白酶、中肠和后肠肌酸激酶(CK)、不同肠段Na+-K+-ATP酶、γ-谷氨酰转肽(y-GT)酶的活性,以及前肠和中肠碱性磷酸酶(AKP)活力(P<0.05)。另外,适宜水平的赖氨酸上调了肠道胰蛋白酶原1、糜蛋白酶原、不同肠段Na+-K+-ATP酶及前肠和中肠CK的mRNA水平(P<0.05)。进一步研究发现,适宜水平的赖氨酸上调了草鱼不同肠段信号分子TOR mRNA水平(P<0.05),下调了后肠4E-BP信号分子mRNA水平(P<0.05),而对前肠和中肠4E-BP mRNA水平无显著影响(P>0.05)。研究结果表明赖氨酸可能通过TOR和4E-BP调控鱼类消化酶和刷状缘酶的基因转录,提高消化吸收能力进而促进鱼类生长。在本试验条件下,以PWG为标识,结合二次回归分析,确定255-489 g草鱼赖氨酸的需要量为14.2 g kg-1饲料(47.3g kg-1蛋白)。2.赖氨酸对草鱼肠道免疫屏障的影响及其可能的机制2.1赖氨酸对草鱼肠道免疫活性分子以及相关信号分子基因表达的影响试验设计同试验一,通过动物试验考察赖氨酸对中期草鱼肠道酸性磷酸酶、溶菌酶、补体C3、抗菌肽、细胞因子及TLR/NFκB信号分子表达的影响,探索赖氨酸对鱼类肠道免疫屏障的影响及其作用方式。结果发现,适宜水平的赖氨酸显著上调了草鱼各个肠段溶菌酶、酸性磷酸酶活力、补体C3含量、Hepcidin和LEAP-2的基因表达(P<0.05)。同时,适宜水平赖氨酸降低草鱼前肠、中肠和后肠IL-8、TNF-α、IFN-γ2和IL-1β的mRNA表达水平(P<0.05),上调了草鱼肠道IL-10和TGF-β的基因表达的水平(P<0.05)。进一步研究发现,适宜水平的赖氨酸下调了草鱼各个肠段信号分子NF-κB、TLR3和TLR4的mRNA水平(P<0.05),上调了各肠段I-κB的基因表达。研究结果表明:赖氨酸通过调节鱼类肠道非特异性免疫、抗菌肽和细胞因子,缓解肠道炎症反应;赖氨酸可能通过TLR/NF-κB信号途径调控细胞因子的基因表达。2.2赖氨酸对草鱼肠上皮细胞细胞因子表达的影响及可能机制为了对赖氨酸调节肠道免疫的信号途径进行更深入的研究,通过细胞试验考察草鱼肠上皮细胞细胞因子和相关信号分子的表达,探索赖氨酸对鱼类肠道上皮细胞细胞因子表达的影响及其可能作用机制。试验设计分两个部分,第一部分是将肠细胞与0-300 mg/L的赖氨酸共培育24h,再暴露于10 μg/ml脂多糖1h,以筛选合适的赖氨酸浓度。抑制试验中,根据试验设计,细胞暴露于240 mg/L的赖氨酸和10 μg/ml脂多糖,以及NF-κB特异性的抑制剂BAY11-7082。结果发现LPS刺激上调了草鱼肠道上皮细胞 TLR4、TLR3、Trif、NF-κB、MyD88、IRF-3、IL-8 和 IL-1 的基因表达水平(P<0.05),降低了 I-κB的mRNA表达,但是添加适宜水平的赖氨酸可以抑制Trif、NF-κB、IRF-3、TLR3、IL-8和IL-1的基因表达水平的上调以及I-κB基因表达水平的下调(P<0.05)。进一步研究发现,添加NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082后,赖氨酸能够抑制LPS诱导草鱼肠道上皮细胞Trif、TLR3、IL-8和IL-1的基因表达水平上调(P<0.05)。研究结果表明:赖氨酸抑制IL-1β和IL-8(促炎因子)的mRNA表达是通过TLR3-NF-KB介导的信号途径而不是TLR4-NF-KB介导的信号途径。3.赖氨酸对草鱼细胞间结构完整性的影响及其可能机制3.1赖氨酸对草鱼肠道紧密连接蛋白以及相关信号分子基因表达的影响本试验设计同试验一,通过考察赖氨酸对草鱼肠道紧密连接蛋白、MLCK和PKC信号分子基因表达的影响,探索赖氨酸对鱼类肠道物理屏障的影响及其可能机制。结果发现:适宜水平的赖氨酸提高了草鱼各个肠段ZO-1、Claudin c、Claudin 12和Occludin,以及前肠和中肠的Claudinb的mRNA水平(P<0.05),下调了各个肠段的Claudin 15、前肠和中肠Claudin 3的mRNA水平(P<0.05)。同时,适宜水平的赖氨酸上调了草鱼中肠和后肠PKC β的mRNA水平(P<0.05),下调了草鱼中肠和后肠MLCK的mRNA水平(P<0.05)。研究结果表明:赖氨酸通过MLCK和PKC信号分子调节鱼类肠道紧密连接蛋白基因表达,维持鱼类肠道物理屏障功能。3.2赖氨酸对草鱼肠道上皮细胞紧密连接蛋白以及相关信号分子基因表达的影响为了对赖氨酸调节肠道紧密连接蛋白的信号途径进行更深入的研究,通过细胞试验考察草鱼肠上皮紧密连接蛋白和相关信号分子的表达,探索赖氨酸对鱼类肠道上皮细胞紧密连接表达的影响及其可能作用机制。结果发现LPS刺激增加乳酸脱氢酶(LDH)活力以及甘露聚糖内流率,降低上皮细胞间跨膜电阻,但是添加适宜水平的赖氨酸能够抑制LDH活力以及甘露聚糖内流率的增加和跨膜上皮电阻的降低,说明赖氨酸能够抵御LPS诱导的水平细胞通透性的增加。进一步研究发现LPS刺激下调了草鱼肠道上皮细胞ZO-1、Claudin c、Claudin 3、Occludin、PKC的基因表达水平(P<0.05),促进了 MLCK的mRNA表达,但是添加适宜水平的赖氨酸可以抑制 ZO-1、Occludin、Claudin3、Claudin c和PKC 的 mRNA 水平的下调和 MLCK 的mRNA水平的上调(P<0.05)。研究结果表明:赖氨酸调节肠道细胞间的通透性可能是通过MLCK/PKC信号途径调控紧密连接蛋白表达。4.赖氨酸对生长中期草鱼细胞结构完整性的影响及其可能的作用途径4.1赖氨酸对生长中期草鱼肠道氧化损伤、抗氧化酶活力和GSH含量及相关信号分子基因表达的影响试验设计同试验一,通过动物试验考察草鱼肠道GSH含量和抗氧化酶活力及Nrf2信号途径相关信号分子基因表达水平,探索赖氨酸对鱼类肠道结构完整性的影响及其作用机制。结果发现:适宜水平的赖氨酸显著降低了草鱼肠道蛋白质羰基(PC)以及丙二醛(MDA)的含量(P<0.05),显著提高了肠道过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活力以及谷胱甘肽(GSH)含量(P<0.05)。同时,适宜水平的赖氨酸上调了草鱼肠道抗氧化酶CAT、CuZnSOD、GPx和GST的基因表达水平(P<0.05),下调了草鱼肠道抗氧化酶GR的mRNA水平(P<0.05)。进一步研究发现:适宜水平的赖氨酸上调了草鱼肠道信号分子Nrf2的mRNA水平(P<0.05),下调了肠道信号分子Keap1b的mRNA水平(P<0.05),对肠道信号分子Keap1a的mRNA水平没有影响。研究结果表明:赖氨酸能够提高鱼类肠道酶性和非酶性抗氧化能力,减少脂质过氧化和蛋白质氧化损伤,维持鱼类肠道结构完整性;赖氨酸提高抗氧化酶活力与其调控抗氧化酶的基因转录有关,抗氧化酶基因转录受Nrf2和Keap1b信号途径的调控。以肠道丙二醛和蛋白质羰基含量为标识,利用二次回归曲线确定生长中期草鱼(255-489g)赖氨酸的需要量为14.2gkg-1饲粮和12.3gkg-1饲粮。4.2赖氨酸对铜诱导的草鱼肠上皮细胞抗氧化损伤保护途径动物试验结果表明适宜量的赖氨酸提高了草鱼肠道抗氧化能力,为进一步探索其作用方式,分别考察赖氨酸对草鱼肠上皮细胞氧化应激的预防、阻截和修复作用,试验主要分为两个部分:试验1共设计7个处理组,每个处理组设4个重复,分别在用6 mg/L铜(Cu)应激处理24小时前、应激同时和应激处理24小时之后,向细胞培养液之中添加6种梯度浓度的赖氨酸(0 mg/L、60 mg/L、120 mg/L、180 mg/L、240 mg/L 和 300 mg/L)处理草鱼肠上皮细胞72小时,确定赖氨酸对鱼肠上皮细胞具有保护作用的最适浓度。结果表明,与空白对照组(Lys:0mg/L,Cu:0mg/L)相比,铜应激(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L)显著提高了细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力,细胞中MDA、PC和MTT含量及ALP活力(P<0.05)。与铜对照组(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L)相比,应激同时和应激后添加180mg/L的赖氨酸显著抑制了铜应激引起的LDH活力的升高(P<0.05),显著恢复了铜应激引起的MTT含量和ALP活力的降低(P<0.05)。研究结果表明,180mg/L的赖氨酸对鱼肠上皮细胞具有保护作用的最适浓度。预防试验共设计3个处理组,每个处理组设计4个重复。在培养液中添加适宜水平赖氨酸(180 mg/L)处理草鱼肠上皮细胞72小时后,用6 mg/L铜(Cu)应激处理24小时,考察赖氨酸对鱼肠上皮细胞是否具有保护作用。结果表明,与空白对照组(Lys:0mg/L,Cu:0mg/L)相比,铜应激(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L)显著提高了细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活力,细胞丙二醛(MDA)、4HNE和蛋白质羰基(PC)的含量(P<0.05),显著降低了 ALP活力和MTT含量(P<0.05)。相对于铜对照组(Lys:0mg/L,Cu:6 mg/L),应激前添加适宜水平的赖氨酸显著抑制了铜应激引起的LDH活力和PC含量的升高(P<0.05),显著恢复了铜应激引起的MTT含量的降低(P<0.05)。相对于空白对照组(Lys:0mg/L,Cu:Omg/L),铜应激(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L)显著增加了抗氧化酶GPx、SOD、GR以及GST的活性(P<0.05),降低了细胞培养液中GSH含量(P<0.05),但是对CAT活性以及抗氧化酶CAT、SOD、GST、GPx和GR的基因表达水平没有显著影响(P>0.05)。与铜对照组(Lys:0mg/L,Cu:6 mg/L)相比,应激前添加适宜水平的赖氨酸显著降低了 CAT的活性(P<0.05)。研究结果表明:应激前添加赖氨酸不能预防由铜应激引起的酶性抗氧化系统的损伤以及脂质过氧化和蛋白氧化损伤。阻截试验共设计3个处理组,每个处理组设计4个重复,在鱼肠道上皮细胞体外培养72小时后,在培养液中添加铜(6 mg/L)诱导氧化应激,与此同时在培养液中添加适宜水平赖氨酸(180mg/L),处理24小时后考察赖氨酸对铜诱导的鱼肠上皮细胞氧化损伤是否具有阻截作用。结果表明:与空白对照组(Lys:0 mg/L,Cu:0 mg/L)相比,铜应激(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L)显著提高细胞MTT、4HNE、80HdG活力、PC和MDA的含量及细胞培养液中LDH活力(P<0.05),降低了细胞ALP的活力(P<0.05)。相对于铜对照组(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L),应激同时添加赖氨酸显著抑制了 MTT、80HdG、4HNE、PC和MDA的含量及细胞培养液LDH活力(P<0.05)。相对于空白对照组(Lys:0mg/L,Cu:0mg/L),铜应激(Lys:0mg/L,Cu:6 mg/L)提高GPx、SOD、GST和GR酶活性和基因表达水平以及Nrf2的mRNA表达水平(P<0.05),同时下调Keap1的mRNA水平和降低了 GSH含量(P<0.05),但是对CAT的酶活性和mRNA表达没有影响(P>0.05)。相对于铜对照组(Lys:0 mg/L,Cu:6mg/L),应激同时处理赖氨酸显著降低了 SOD、GR、GST和GPx的活性和基因表达以及Nrf2的mRNA水平(P<0.05),上调了 GSH含量和Keap1的mRNA水平(P<0.05),对CAT活力和基因表达水平没有影响(P>0.05)。同时,和铜对照组(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L)相比,应激同时处理赖氨酸显著降低了培养液中Cu2+水平(P<0.05)。研究结果表明:赖氨酸能通过螯合Cu2+阻截由铜应激引起的酶性抗氧化系统的损伤,显著降低脂质过氧化和蛋白氧化损伤。修复试验同样设计3个处理组,每个处理组设计4个重复,在鱼肠道上皮细胞体外培养72小时后,首先用6 mg/L铜处理草鱼肠上皮细胞24小时,然后再在培养液中添加适宜水平赖氨酸(180mg/L),继续处理72小时,考察赖氨酸对铜诱导的鱼类肠上皮细胞氧化损伤是否具有修复作用。结果显示:相对于空白对照组(Lys:0 mg/L,Cu:0mg/L),铜应激(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L)显著提高草鱼肠上皮细胞LDH的释放(P<0.05),增加了肠上皮细胞MTT、80HdG、PC和MDA的含量(P<0.05),降低了肠上皮细胞ALP和PSM活性(P<0.05)。相对于铜对照组(Lys:0 mg/L,Cu:6 mg/L),应激后添加赖氨酸显著降低了细胞培养液中LDH活力,细胞80HdG、MDA和PC含量(P<0.05),增加了 ALP和PSM活力及MTTOD值(P<0.05)。与空白对照组相比(Lys:0mg/L,Cu:0mg/L),铜应激(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L)显著降低了 GR活力和GSH的含量以及GR和Keap1的mRNA表达(P<0.05),增加CAT、SOD、GST和GPx酶活力以及CAT、GST、GPx的基因表达水平(P<0.05),而对Nrf2和SOD基因表达没有影响(P>0.05)。与铜对照组相比(Lys:0mg/L,Cu:6mg/L),应激后添加适宜水平的赖氨酸提高了 GR的活性和mRNA水平以及GSH的含量(P<0.05),降低了 GST和CAT的酶活性以及GST的mRNA水平(P<0.05),对GPx和SOD酶活性以及CAT、SOD、GPx、Nrf2和Keap1的基因表达没有影响(P>0.05)。研究结果表明:赖氨酸能够修复铜应激引起的酶性抗氧化系统损伤,降低鱼类肠上皮细胞氧化损伤。综上所述:适宜量的赖氨酸能提高鱼类生长性能和消化吸收能力,消化吸收能力的提高与其促进肠道和肝胰脏的生长发育、提高消化酶和刷状缘酶的活性及调控消化酶和刷状缘酶基因转录有关,而消化酶和刷状缘酶基因转录受上游信号分子TOR和4E-BP调控。另外,赖氨酸能调控鱼类肠道紧密连接蛋白的基因转录;紧密连接蛋白基因转录的调节与其调控PKC和MLCK信号分子有关。赖氨酸能调节肠道抗菌物质分泌和细胞因子的表达,维持鱼肠道免疫屏障功能;细胞因子基因转录的调节与其调控TLR和NF-κB信号分子有关。赖氨酸通过提高肠道和肝胰脏的非酶性和酶性抗氧化能力,减少脂质过氧化和蛋白质的氧化损伤,从而保证鱼类肠道结构完整性;抗氧化能力的提高与其调控抗氧化酶和Nrf2途径相关信号分子(Nrf2和Keap1)基因转录有关。进一步研究发现赖氨酸能通过阻截和修复的两种作用方式增强鱼类肠上皮细胞抗氧化损伤的能力。在本试验条件下,以PWG为标识,结合二次回归分析,得到255-489 g草鱼赖氨酸的需要量为14.2 g kg-1饲料(47.3g kg-1蛋白)。