研究目的:神经病理性疼痛的一种共同的内在机制是损伤或受到影响的神经发生炎症。这种炎症反应引起一连串的事件导致先天免疫细胞集中到损伤组织附近并被激活。包括细胞因子,神经营养因子和趋化因子在内的免疫活性物质的释放引起局部反应,并进一步导致更广泛的免疫反应。外周和中枢神经系统的致敏是神经病理性疼痛发生和维持的主要原因,而炎症免疫机制是调节这些环节的关键。神经病理性疼痛在中医辨病辨证中归于“痹证”范畴,中药复方身痛逐瘀汤具有身痛逐瘀汤具有行气活血逐瘀,祛风除湿止痛之功效,作为治疗痹证尤其是瘀血痹的代表方。现代药理研究证明,全方具有显著的抗炎,镇痛,改善微循环以及抗变态反应作用。基于二代测序技术的高通量测序(RNA-Seq)技术是目前应用最广泛的转录组测序技术,能快速获得检测样本的全部遗传信息。RNA-Seq具有实验成本低以及高通量特性等优点,可用来研究基因的结构和功能,鉴定基因表达量的变化,探究调控的可变剪接模式等。在生命科学领域,该技术已被用来探寻疾病的发生机制、临床的诊断以及药物药理学研究等。因此本研究将基于RNA-Seq技术探究身痛逐瘀汤在治疗神经病理性疼痛中潜在的作用靶点,为该疾病治疗提供新的线索和理论依据。研究方法:1)通过文献检索,探究身痛逐瘀汤治疗神经病理性疼痛的作用机制,将检索结果和RNA binding为关键词在Genecard数据库中进行检索,寻找和神经病理性疼痛相关的RBP基因,经筛选确定该RBP基因为我们的研究对象;2)构建RBP基因的过表达载体;3)转染hela细胞,转染后RT-Q-PCR检测STAU1基因的表达水平变化以及western blot检测蛋白的表达;4)用MTT法检测该RBP基因过表达对细胞增殖的影响。5)用RNA-seq分析RBP基因过表达的转录调控。设立对照细胞和过表达细胞(各两生物重复样本)四个样品组,将四组样品的总RNA分别制备cDNA文库,建库后进行测序分析;6)探寻RBP基因调控的差异表达基因以及富集到GO或KEGG数据库中的生物过程或信号通路;7)探究RBP基因调控的可变剪切事件以及相关基因富集到GO或KEGG数据库中的信号通路;8)用荧光定量Q-PCR验证RNA-seq中检测的差异表达基因和差异可变剪接的基因。研究结果:1)发现身痛逐瘀汤通过p38MAPK通路在神经痛发生中发挥重要作用,同时,检出基因STAU1和神经疼痛相关,且该基因为双链RNA结合蛋白,和p38MAPK通路相关;2)本实验构建成功的具有GFP荧光标签和flag标签(与目的基因融合)的STAU1载体;3)荧光显微镜下观察载体转染后GFP荧光表达效果,确认细胞转染成功。RT-Q-PCR检测结果显示STAU1载体转染细胞48h之后基因有明显的过表达,Western blot的结果在50-70kd之间有目的条带,显示STAU1载体转染成功,且有明显的过表达;4)MTT法检测显示基因STAU1过表达对细胞的增殖具有促进作用。5)测序结果获得高质量转录组数据,碱基质量Q30的平均值为93.93%。样本间相关性分析证明STAU1 OE细胞和对照细胞之间、两生物学复制样本之间均高度相关;6)探MA plot显示:由STAU1过表达引起的显著差异表达基因有801个,其中上调表达基因423个,下调表达基因378个,这表明STAU1在Hela细胞中广泛调控基因转录。过表达STAU1正调控HeLa细胞中IFIT2、OASL、IFIT3的表达以及负调控CCL2基因表达,四个基因均与炎症和免疫应答相关;7)STAU1可全局调控Hela细胞中基因组的可变剪切事件,调控的部分差异可变剪接基因富集于神经生长因子受体信号通路(P-Value约为0.01)。对神经生长因子受体信号通路中挑选的6个基因进行可变剪接事件的检测,可见明显的可变剪接差异,表明STAU1对神经元的存活、分化、生长、以及损伤后的修复和再生具有重要意义。8)通过Q-PCR验证的差异表达基因和可变剪接事件与RNA测序结果基本一致,进一步证实了我们研究结果的可靠性。研究结论:我们知道,身痛逐瘀汤通过p38MAPK通路在神经痛发生中发挥重要作用,通过研究与p38MAPK以及神经疼痛相关基因STAUl,证实了过表达STAUl对hela细胞基因转录和可变剪接的全局调控,同时发现,STAUl对参与炎症及免疫反应发生相关功能的基因转录具有显著调控作用,同时还调控富集到参与调节神经元生长和修复相关基因的神经生长因子受体信号通路、逆向运输、转录调控和肌细胞分化等通路中基因的可变剪接。该研究为今后在神经病理性疼痛治疗提供了新的线索,提示了STAU1是身痛逐瘀汤在神经病理性疼痛治疗上的潜在作用靶点。