缺血性脑卒中多是由于血栓形成,造成梗阻血管供血区域氧气、营养物质供应中断。缺血中心区神经元因急性氧糖剥夺发生坏死,无法挽救;而缺血中心区周围的半暗带神经元则发生渐进性凋亡,仍有机会挽救。近年来,脑缺血再灌注诱发的神经元凋亡是神经科学研究的热点之一,开发能够切实保护神经元、抵抗凋亡的治疗方法具有重要的现实意义。神经元缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤可以诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),进一步激动未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。若ERS未超过细胞代偿能力,通过UPR解除ERS,神经元将不会发生凋亡;若损伤刺激过强,ERS过强、持续时间过长,最终活化促凋亡分子C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)等,神经元将发生凋亡。已证实ERS及ERS诱发的凋亡是I/R损伤的重要机制之一,葡萄糖调节蛋白78(78 KDa Glucose-Regulated Protein,GRP78)/真核细胞翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,e IF2α)-活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)-CHOP信号通路是其中的关键分支。蛋白激酶CK2(Casein kinaseⅡ,CK2)是一种多功能、高度保守的丝/苏氨酸蛋白磷酸转移酶,CK2在多种细胞模型中起着促进细胞存活,抵抗凋亡的作用。特别在肿瘤细胞中CK2上调,使细胞对凋亡刺激不敏感;而抑制CK2则诱发肿瘤细胞ERS,进而凋亡。但在神经系统中CK2是否参与调制ERS,尚未见报道。本研究将着眼于ERS分支之一的GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP信号通路,研究脑I/R损伤是否激动此信号通路,并探究在神经元中CK2是否参与调制其活化。神经肽Apelin为G蛋白耦联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)血管紧张素AT1相关受体(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1,APJ)的内源性配体之一。近年来有报道Apelin具有神经保护作用,可对抗兴奋性毒性损伤、氧化应激、血清剥夺诱发的凋亡、缺血再灌注诱导的凋亡等,但其机制尚未明确。本研究将重点探讨Apelin/APJ是否参与调节CK2的表达,是否调制ERS的激动,并研究可能的信号转导机制。本研究首先以Wistar大鼠构建大脑中动脉栓塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型,通过Western blot检测MCAO-2h/R 0h、12h、24h、72h不同时间点ERS的重要分支GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP各个分子表达水平,发现MCAO/R诱导GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP通路活化。其中GRP78作为上游的分子伴侣,表达高峰出现在MCAO-2h/R-12h,eIF2α磷酸化水平、ATF4、CHOP表达水平均显著升高,于MCAO-2h/R-24h达峰值。此外,我们采用Western blot检测MCAO/R不同时间点CK2的催化亚基CK2α、调节亚基CK2β的表达变化,发现随MCAO/R进展,CK2α、CK2β进行性降低。原代皮层神经元制备氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,同样证实OGD/R诱导GRP78/e IF2α-ATF4-CHOP通路活化,同时伴随CK2α、CK2β进行性下调。接下来通过免疫细胞化学染色观察催化亚基CK2α在神经元内的分布,发现部分CK2α免疫阳性可以与内质网特异性标记物KDEL共定位,即部分CK2α分布于内质网中,因此有可能与内质网膜上、内质网中的蛋白质相互作用。以CK2化学性抑制剂CX-4945及特异性CK2αsiRNA处理原代皮层神经元,酶活性检测提示CX-4945可有效抑制CK2活性,CK2αsiRNA通过抑制CK2α表达也可显著抑制CK2。Western blot结果显示不论CK2活性抑制或催化亚基表达抑制,均可显著激活GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP信号通路。TUNEL染色结果显示,抑制CK2活性或抑制CK2α表达均可诱发神经元凋亡。证实在神经元中CK2可能是ERS的负性调节因子,脑I/R损伤导致的CK2抑制是ERS及凋亡的诱因。本研究以Wistar大鼠制备MCAO/R模型,侧脑室注射Apelin-13(0.5μg/g)预处理,通过TTC染色检测梗死灶体积,可见MCAO/R可诱发明显的梗死灶,而Apelin-13可显著减小梗死灶体积,Western blot结果显示Apelin-13可有效抑制GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP通路激活,同时上调CK2α及CK2β表达。原代皮层神经元制备OGD/R模型,Apelin-13(10nmol/L)预处理可显著减轻乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)释放,上调CK2α及CK2β,提高CK2酶活性,抑制GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP通路中各分子的表达,显著抑制神经元凋亡。如前证实在体与离体模型中Apelin-13均可抑制ERS,同时上调CK2表达,而CK2可能为ERS的负性调节因子,因此推测Apelin-13抑制MCAO/R或OGD/R诱发的ERS及凋亡可能是通过上调CK2实现的。进一步实验以CK2αsiRNA抑制其表达,发现Apelin-13上调CK2α、提高CK2酶活性、抑制GRP78/e IF2α-ATF4-CHOP激活、抑制凋亡的效应均被逆转,但Apelin-13仍可促进CK2β表达,接近基础值。证实(1)神经元中CK2活性主要来自其催化亚基CK2α;(2)CK2β并不参与调制ERS,CK2α为ERS的负性调节因子;(3)Apelin-13可同时上调CK2α、CK2β,通过CK2α抑制ERS及凋亡。已有报道APJ主要与Gα_i或Gα_q耦联,为验证Apelin/APJ对CK2的调节是通过何种信号转导实现的,进一步实验以原代皮层神经元制备OGD/R模型,给予Gα_i抑制剂PTX或Gα_q抑制剂UBO-QIC及Apelin-13。Western blot结果显示,Apelin-13可逆转OGD/R损伤导致的CK2α下调、CHOP活化,Gα_i抑制剂PTX、Gα_q抑制剂UBO-QIC均能阻断Apelin-13的作用,且效果相近。TUNEL染色同样证实Apelin-13可显著降低凋亡率,而Gα_i抑制剂PTX、Gα_q抑制剂UBO-QIC均逆转了Apelin-13的作用,两者效果相近。说明Apelin-13对CK2α的调制既可通过Gα_i又可通过Gα_q,即Apelin/APJ可通过Gα_i或Gα_q调制CK2α,从而实现对GRP78/e IF2α-ATF4-CHOP信号通路的调控。综上所述,本研究发现:(1)缺血性脑卒中可激动内质网应激的重要分支GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP信号通路;(2)缺血性脑卒中可导致蛋白激酶CK2催化亚基CK2α、调节亚基CK2β下调,即CK2抑制;(3)首次证实在神经元中CK2为内质网应激的负性调节因子,CK2活性抑制或CK2α表达抑制均可诱发ERS及凋亡;(4)首次证实缺血性脑卒中导致的CK2抑制是GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP信号通路活化并诱发凋亡的原因,这也是脑缺血再灌注损伤的主要机制之一;(5)首次发现Apelin-13通过上调CK2α从而抑制内质网应激及其诱导的凋亡,Apelin-13也可上调CK2β,但并不参与损伤调节机制;(6)首次发现Apelin-13/APJ通过Gα_i/Gα_q实现信号转导,调制CK2α-GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP信号通路,从而保护神经元、抵抗内质网应激及其诱导的凋亡。本研究首次证明了在神经元中CK2,主要是其催化亚基CK2α,为内质网应激的负性调节因子,脑缺血再灌注损伤诱发的CK2抑制是内质网应激及凋亡的诱因,而Apelin/APJ通过Gα_i/Gα_q上调CK2α,从而实现对GRP78/eIF2α-ATF4-CHOP信号通路的调制,抑制凋亡。上述结果为进一步研究Apelin/APJ及CK2的神经保护作用提供了一定的理论依据。本研究证实APJ、内质网应激关键通路及蛋白激酶CK2,特别是CK2α,可作为缺血性脑卒中新的治疗靶点,开发针对内质网应激的药物,或者APJ和CK2的激动剂,在理论上具有较高的实践价值,但仍需进一步研究。