葡萄（Vitis spp.）是跨越南北半球栽培且具有重要经济价值的果树。欧洲葡萄（V.vinifera）品种果实风味纯正、品质优良,成为葡萄生产上的主要来源,但抗病性差。白藜芦醇不仅在植物体内是一种植保素,可以保护植物抵抗病原菌的入侵,而且还对人体健康有益。中国是世界葡萄重要原产地之一,蕴藏着丰富的种质资源与抗病株系。中国野生毛葡萄（V.quinquangularis）丹凤-2不仅拥有较高含量的芪类物质,而且表现了较高的抗病性。本课题组前期对丹凤-2果实不同发育时期进行转录组测序,以欧洲葡萄‘黑比诺’基因组为参考,鉴定到一批新的转录本,特别是在成熟果实中高表达的6条新的芪合成酶转录本。本研究利用同源克隆技术分离这六条新的芪合成酶转录本,分析其基因序列与结构;通过遗传转化欧洲葡萄‘无核白’获得转基因葡萄,鉴定其抗白粉病功能;筛选调控这些新转录本的上游转录因子及其功能,揭示中国野生葡萄中存在新的芪合成酶并具有抗病功能,为葡萄抗病育种提供依据。主要取得以下结果:1.从中国野生毛葡萄丹凤-2中克隆获得芪合成酶基因家族具有功能的5条新成员采用同源克隆法获得中国野生毛葡萄丹凤-2中新发现的6条芪合成酶转录本（VqNSTS1-VqNSTS6）,其中VqNSTS1基因长619bp,没有芪合成酶家族保守特征序列,并存在碱基缺失和终止密码子提前现象,为假基因;VqNSTS2、3、5、6基因长1179 bp,编码393个氨基酸;VqNSTS4基因长1035 bp,编码345个氨基酸,与典型的STS序列相比在N端缺失48个氨基酸。根据芪合成酶家族的保守特征序列与已报道的STS进行序列比对,发现VqNSTS2-VqNSTS6均存在相似的保守特征序列与较高的同源性,但存在碱基/氨基酸的缺失和突变。其中,VqNSTS2、3、4具有与黑比诺相同的芪合成酶家族的保守特征序列,而VqNSTS5、6在IPNSAGAIAGN保守序列中存在两个氨基酸突变。将获得的这些新芪合成酶转录本序列提交GenBank,登录号为:OL589476-OL589481。随后,采用瞬时转化烟草叶片和PEG介导的拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,表明VqNSTS2-VqNSTS6均定位在细胞质。进一步将VqNSTS2-VqNSTS6瞬时过表达至烟草叶片中,采用HPLC-MS技术检测到芪合成酶基因的表达产物芪类物质,表明VqNSTS2-6是中国野生毛葡萄丹凤-2芪合成酶基因家族中具有功能的新成员。2.鉴定了葡萄芪合成酶基因VqNSTS2-6参与了对白粉病的抗病响应采用qRT-PCR研究VqNSTS2-VqNSTS6对白粉菌的响应,结果表明VqNSTS2和VqNSTS4对白粉菌的响应较为强烈,作为本研究的重点目标基因进行研究。将具有典型STS序列长度的VqNSTS2转化感病的欧洲葡萄‘无核白’并获得了转基因过表达植株。通过PCR,qRT-PCR和western blot对转基因植株进行鉴定发现转化的基因整合到了目标基因组中并得到了表达。VqNSTS2的过表达不仅促进了芪类物质含量的增加,而且引起苯丙氨酸途径中上游PAL基因和分支途径CHS基因的表达量增加。对VqNSTS2过表达转基因葡萄植株接种白粉菌,通过观察接菌后表型,计算孢子数量,进行台盼蓝、DAB和苯胺蓝染色,表明VqNSTS2过表达后可以增强葡萄植株对白粉菌的抗性。相对于野生型‘无核白’,过表达转基因植株具有较少的菌落数和孢子数量,菌丝生长缓慢,产生较多的过氧化氢和胼胝质沉积,出现细胞坏死现象;同时芪类物质的含量在接种白粉菌后显著增加;通过qRT-PCR发现VqNSTS2转基因葡萄植株主要激活了过氧化氢和SA合成途径中相关基因如RBOHD、GST1、PR1和PR5的表达。此外,在中国野生毛葡萄丹凤-2中瞬时干扰VqNSTS2和VqNSTS4,导致葡萄叶片对白粉菌表现出更加易感的现象。3.鉴定了调控VqNSTS2和VqNSTS4基因表达的转录因子VqERF062和VqAL4通过染色体步移法克隆获得VqNSTS2-VqNSTS6的启动子序列,分析发现ProVqNSTS2、ProVqNSTS3、ProVqNSTS4、ProVqNSTS6 上均存在WRYKY 和 MYB 转录因子的结合位点。首先根据本课题组前期研究结果和相关文献报道,验证WRKY转录因子 VqWRKY2、VqWRKY3 和 VqWRKY53,以及 MYB 转录因子 VqMYB14、VqMYB15和VqMYB154对VqNSTS2-VqNSTS6的调控关系。采用酵母单杂交和双荧光素酶报告试验证明VqMYB154可以直接结合ProVqNSTS2并促进VqNSTS2的表达;VqWRKY3或VqWRKY53可以直接结合ProVqNSTS3并促进VqNSTS3的表达;VqMYB14可以直接结合ProVqNSTS6并促进VqNSTS6的表达;但这六个转录因子均不能参与对ProVqNSTS4和ProVqNSTS5的调控。随后,根据前期转录组数据的共表达分析,鉴定到八个可能调控VqNSTS2的候选转录因子基因,其中VqERF062对VqNSTS2启动子激活活性最强。通过双荧光素酶报告试验、酵母单杂交、EMSA和农杆菌介导的瞬时转化试验,结果表明VqERF062可以直接结合VqNSTS2启动子中的DRE（ACCCAC/GTGGGT）和RAA（CAACA/TGTTG）元件并促进其表达,从而促进芪类物质的积累。此外,本研究采用双荧光素酶报告试验、ChIP-qPCR和农杆菌介导的瞬时转化试验进一步证明了 VqAL4可以结合VqNSTS4启动子中的G-rich（CACCTC/GAGGTG）元件促进芪类物质积累。4.确定了葡萄转录因子VqERF062和VqAL4参与对葡萄白粉病的抗性响应采用PCR,qRT-PCR和westernblot鉴定获得VqERF062的过表达和干扰植株。与野生型葡萄相比,过表达VqERF062的转基因植株叶片的菌落数和孢子数均较少,产生细胞坏死,且积累了大量的过氧化氢和胼胝质,芪类物质在接种白粉菌后显著增加,过氧化氢和SA途径的相关基因（RBOHD、GST1、PR1和PR5）也参与了抗白粉病的过程。此外,采用酵母双杂交、BiFC、Pull-down和荧光共振能量转移试验证明VqERF062可以与VqERF1B以及VqbHLH137分别互作形成复合体,这种复合体增强了 VqERF062对中国野生毛葡萄VqNSTS2启动子的激活活性。同样地,转录因子VqAL4的过表达转基因葡萄在白粉菌侵染时,表现出葡萄素增多,并增强对白粉菌的抗性;相反,在中国野生毛葡萄丹凤-2中瞬时干扰VqAL4,导致干扰叶片在白粉菌侵染时表现出对白粉菌更加易感的现象,进一步证明了转录因子VqAL4的抗病特性。5.揭示了葡萄芪类物质云杉新苷降解产生白藜芦醇提高植株的抗病性为了研究在病原菌入侵时,云杉新苷是否可以水解产生具有抗菌性的白藜芦醇,利用qRT-PCR对葡萄糖基水解酶家族1中的38个基因进行白粉菌诱导后的表达分析,获得一个在丹凤-2中较强响应白粉菌的糖基水解酶基因VqBGH40a。通过在烟草叶片和拟南芥原生质体中进行亚细胞定位分析,发现其定位于细胞质膜。通过将VqBGH40a在大肠杆菌中进行原核表达分析,表明VqBGH40a在植物体外可水解云杉新苷生成白藜芦醇。通过农杆菌介导的丹凤-2叶片瞬时转化试验,并接种白粉菌,表明VqBGH40a在植物体内可水解云杉新苷生成白藜芦醇,且这种可逆性变化受白粉菌入侵正向促进,从而参与植物抗病。综上所述,从中国野生毛葡萄丹凤-2中克隆获得具有功能的5个芪合成酶新成员VqNSTS2-VqNSTS6,其中VqNSTS2和VqNSTS4的表达分别受VqERF062和VqAL4的正向调控。VqNSTS2、VqNSTS4、VqERF062以及VqAL4的表达增强了葡萄对白粉菌的抗性。苯丙氨酸途径中由白藜芦醇衍生的云杉新苷,在白粉菌侵染时,被葡萄植株体内的糖苷水解酶VqBGH40a水解生成白藜芦醇,增强葡萄抗病性。综上,本研究进一步解析了葡萄芪类物质代谢参与抗白粉病的机理,并证明了中国野生毛葡萄丹凤-2是抗病育种的重要种质资源。