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水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AMD),是危害世界养貂业的主要疾病之一,其病原为水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)感染表现为慢性、持续性、进行性感染,皮兽群毛皮质量下降,种兽群繁殖能力降低,又称为浆细胞增多症。由于该病致病机理特殊,目前仍未研制出有效疫苗用于防控该病。研究表明,AMDV的限制性低水平复制与表达,可以导致病貂的持续性感染和免疫复合物的形成,引发慢性疾病,而细胞凋亡在这一致病过程中发挥重要作用。通常体外连续培养病毒是研究病毒致病机理以及强毒致弱获得弱毒疫苗侯选毒株最常规的方法。本试验对实验室分离鉴定的强毒株进行体外连续传代培养,对不同代次、不同毒力的病毒增殖特性及凋亡特性进行研究,为AMDV致病机理研究以及弱毒疫苗侯选毒株筛选奠定基础。设计特异性引物,通过反应条件的优化,建立了AMDV荧光定量PCR检测方法,该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性。为AMDV临床检测及AMDV在CRFK细胞的增殖评价提供技术支持。对实验室分离鉴定的AMDV强毒株AMDV-DL124和AMDV-DL125株第7代(F7)细胞毒在CRFK细胞中进行体外培养,通过培养条件优化,目前已连续传代至45代(F45)。通过病毒含量测定、间接免疫荧光试验和荧光定量PCR试验对AMDV-DL124、AMDV-DL125毒株F7代及F45代细胞毒和标准弱毒株AMDV-G株在CRFK细胞的增殖特性进行研究。结果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株病毒F7代毒的病毒含量可达108.5 TCID50/mL、明显高于F45代毒的病毒含量106 TCID50/mL和AMDV-G 105.5 TCID50/mL,而F45代毒和和AMDV-G株间,病毒含量无明显差异;间接免疫荧光试验结果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株在48-72h增殖速度较快,在12-24h增殖速度较慢;荧光定量PCR试验结果表明,随着培养时间的延长AMDV在CRFK细胞的核酸量不断增加,在感染后12h后增加明显,但AMDV-DL124、AMDV-DL125核酸量的峰值可达2.4×106个拷贝,明显高于F45代病毒和AMDV-G株病毒,而后二者之间无明显差异。上述结果表明,AMDV强毒株AMDV-DL124和AMDV-DL125经CRFK细胞连续培养传代后在CRFK细胞的增殖能力降低。应用流式细胞术及TUNEL法检测AMDV-DL124、AMDV-DL125株F7代及F45代病毒和标准弱毒株AMDV-G诱导CRFK细胞凋亡情况。流式细胞术检测AMDV诱导CRFK细胞凋亡率结果表明,AMDV-DL124、AMDV-DL125株F7诱导CRFK细胞的凋亡率在感染后12h达最大值15.86%,明显高于F45代和AMDV-G株诱导CRFK细胞凋亡率2.94%、1.65%,细胞凋亡主要集中在病毒感染后2~12h。TUNEL法测定结果表明病毒在感染后12h出现明显凋亡;上述结果表明,AMDV-DL124和AMDV-DL125株经CRFK细胞连续传代后诱导CRFK细胞凋亡的能力降低。本研究为后续AMDV致病性与细胞凋亡关系的研究奠定基础。