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丝状真菌是药物发现的重要源泉，许多临床广泛使用的药物如青霉素，洛伐他汀和环孢菌素A等都是从丝状真菌中发现的。因此，建立普遍适用于丝状真菌的基因敲除法对于提高丝状真菌中活性代谢产物的含量、丰富其化学多样性具有重要意义。CRISPR-Cas9系统是一种新型的基因敲除技术，由Cas9核酸酶和向导RNA（gRNA）两部分组成。自2013年以来，该系统已成功应用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、酵母、细菌、果蝇、线虫、拟南芥、水稻等多个物种，近两年来，该系统在丝状真菌中也被广泛应用。然而，目前在丝状真菌的研究仅限于遗传转化方法成熟的模式菌株（曲霉属、脉孢菌属、青霉属等），且研究的对象多为一种菌株或者同属的几种菌株，而且在不同的菌株中敲除效率差别较大，有些菌株中敲除效率只有10%左右。因此，迫切需要建立一种高效且普遍适用于丝状真菌的基因敲除方法。 本研究选择研究较少的多节孢属真菌Nodulisporium sp.（No.65-12-7-1）为对象，拟在该菌株中建立一种高效的CRISPR-Cas9基因敲除法。首先，要建立该菌株的遗传转化方法，用于Cas9和gRNA的导入。PEG介导的原生质体遗传转化方法是最为广泛使用的方法。通过考察酶、酶解时间以及菌龄对原生质体质量和数量的影响，确立了该菌株的原生质体制备条件：选择菌龄为24h的菌丝，用Yatalase酶酶解1h。通过考察PEG和Ca2+浓度对转化效率的影响，选择60%的PEG与50mM的Ca2+作为原生质体的转化条件。于是，首次建立了多节孢属真菌的PEG介导原生质体遗传转化方法。在此基础上，利用PEG介导原生质体遗传转化法首先将Cas9表达质粒导入到多节孢属真菌中，成功构建了Cas9稳定表达菌株。接着，采用了三种方式将gRNA导入到Cas9稳定表达菌株中：U6启动子驱动的gRNA体内表达法、体外转录gRNA与抗性质粒共转法以及体外转录gRNA与线性抗性片段共转法。结果发现，第三种方法，即将体外转录的gRNA与线性抗性片段同时转化Cas9稳定表达菌株时，平均敲除效率达到了68.3%，远高于其它两种方法。而且，还发现在所有的敲除菌株中，基因突变都是通过线性抗性片段插入Cas9切割位点实现的，而使用抗性质粒时没有发现此种现象。提示线性抗性片段不仅可用于转化子的筛选，而且能通过将其自身插入Cas9切割位点来提高敲除效率。为了探讨该方法是否适用于其它丝状真菌，在其它两株与多节孢属亲缘关系很远的菌株：米曲霉（Aspergillus oryzae）和小荚孢腔菌（Sporormiella minima）进行了验证，结果表明该方法也能在这两株真菌中高效地敲除目标基因。综上，本研究建立一种高效的且普遍适用于丝状真菌的CRISPR-Cas9基因敲除法，为利用生物合成方法提高丝状真菌的活性代谢产物的含量，丰富其化学多样性奠定了坚实基础。