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副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐的革兰氏阴性杆菌,对人类危害仅次于霍乱孤菌,是世界范围内重要的食源性致病菌,主要分布在海洋环境中。群体感应（quorum sensing）是细菌通过产生自体诱导因子感知细胞密度的变化从而调节相关基因表达的一种调控机制,细菌利用群体感应适应不同的生存环境的需求。革兰氏阴性细菌的群体感应系统由Lux I型自诱导物合成酶和LuxR型受体蛋白组成。Lux I型自诱导物合成酶合成酰基高丝氨酸内酯（Acyl Homoserine Lactone,AHL）,LuxR型受体通过与AHL分子结合,调控其下游基因的表达。但是,许多细菌具有LuxR同源物,但缺乏相关的Lux I型AHL合酶。这些LuxR型受体称为“-LuxR孤儿”。在副溶血弧菌中,还没有找到Lux I型自诱导物合成酶的同源物,它的自体诱导物还不是很清楚。调控副溶血弧菌合成自体诱导物的基因很可能存在于LuxR家族中,它可能感知环境信号因子,或者感知其它细菌的信号因子而对自身的表型进行调控。本研究的目的在于探索在副溶血弧菌的群体感应系统中除了Aph A和Opa R,还有哪些群体感应调节剂发生了作用。为了研究副溶血弧菌LuxR家族基因的功能,通过氨基酸同源比对发现,在副溶血弧菌中含有17个LuxR蛋白同源基因,通过在副溶血弧菌中构建16个LuxR家族基因的缺失突变株,检测这些缺失株在生长、运动性、群集运动、生物膜形成能力、毒力方面以及群体感应功能的表型,结果发现,当vp1945缺失后,副溶血弧菌的生长减弱;当vp2009、vp2866缺失后（△vp2009、△vp2866）,副溶血弧菌的运动性显著增强,并且△vp2866、△vp2009菌株的运动性增强很可能是因为其生长速度增强所产生的。当vp2516、vpa0369缺失后（△vpa0369、△vp2516）,突变株的生物被膜形成能力显著增强;利用果蝇动物模型研究副溶血弧菌野生型菌株以及其他基因缺失株的毒力发现,vp2866、vpa0369缺失后,副溶血弧菌的毒力增强。通过构建哈氏弧菌lux-box与荧光报告质粒融合表达,在副溶血弧菌LuxR家族基因缺失株中检测lux-box的转录效率,以此反应细菌群体感应的强度。结果显示,与副溶血弧菌野生型相比,△vpa0369、△vpa1446、△vpa1447、△vpa1623和△vpa1729的发光显著降低,这表明这些LuxR家族调节因子介导了副溶血性弧菌的群体感应调控过程。为了进一步研究vp2009、vp2866、vpa0369基因的功能,首先通过转录组分析筛选受VP2009、VP2866、VPA0369调控的目的基因。通过比较基因缺失株与野生型菌株的转录组发现,当vp2009缺失后,247个基因的表达被显著上调,384个基因的表达被显著下调;当vp2866缺失后,有275个基因被显著上调,326个基因被显著下调;当vpa0369缺失后,有278个基因被显著上调,237个基因被显著下调。利用RT-PCR检测通过转录组筛选到的受VP2009、VP2866、VPA0369调控的部分目的基因的转录,包括与细菌调节蛋白功能相关的vp1277基因,与分泌蛋白功能相关的vpa0807基因,与T6SS2功能相关的vpa1027、vpa1038两个基因,以及与胞外多糖合成功能相关的vpa1403基因。RT-PCR检测的结果与转录组结果一致,说明本次转录组数据可靠。随后对VP2009转录组数据进行GO（Gene Ontology）分析发现,VP2009参与副溶血弧菌多种生理过程,包括生物过程（药物跨膜转运、药物转运、离子跨膜转运等）、细胞组成（细胞膜、被膜等）、分子功能（周质空间、转运运动等）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）代谢通路变化分析显示,VP2009影响副溶血弧菌氧化磷酸化、磷酸转移酶系统（PTS）、果糖和甘露糖代谢、硫代谢等过程。这些结果显示VP2009可作为一个全局调控因子,在副溶血弧菌生理代谢过程中具有重要作用。另外,为了验证VP2009对这些目的基因的调控是直接的还是间接的,通过构建目的基因启动子与荧光报告基因融合,在副溶血弧菌野生型菌株、vp2009缺失株中检测这些目的基因启动子的转录效率。结果发现,当vp2009缺失后,vp2010、vp2011、vp2015的表达显著下调,vp1027、vp1043、vpa1044、vp2516、vp2762的表达显著上调。为了验证VP2009-2010是否特异性的直接调控vp2009-2010、vp2011-2014、vp2015-2016这三个基因簇的表达,通过构建VP2009-2010共表达质粒,在大肠杆菌中检测VP2009-2010调控目的基因的转录。结果发现,VP2009/2010可以在大肠杆菌中直接激活vp2009-2010、vp2011-2014、vp2015-2016这三个基因簇的表达。通过电泳凝胶阻滞实验检测VP2009与目的基因启动子的结合,结果发现VP2009可以与vp2009-2010、vp2011-2014、vp2015-2016这三个基因簇的启动子序列结合。这些结果都说明VP2009/2010可以特异性的直接调控vp2009-2010、vp2011-2014、vp2015-2016这三个基因簇的表达。vp2011-2014、vp2015-2016这两个基因簇的功能与细菌在厌氧条件下利用连四硫酸钠进行呼吸作用相关,而vp2009-2010位于这两个基因簇的上游,推测VP2009/2010的调控功能与副溶血弧菌利用连四硫酸钠有关,而通过检测连四硫酸钠对VP2009/2010的调控功能的作用也发现,在副溶血弧菌和大肠杆菌中,连四硫酸钠都可增强VP2009/2010激活下游基因表达的功能。利用小鼠定殖模型研究VP2009/2010对副溶血弧菌在小鼠肠道中定殖的作用发现,与野生型菌株相比,vp2009、vp2010、vp2014、vp2015-2016这些基因缺失株在小鼠肠道定殖能力显著减弱,这说明VP2009/2010及其调控的下游基因对副溶血弧菌在小鼠肠道中定殖具有重要的作用。综上所述,本研究以研究副溶血弧菌LuxR家族基因功能为切入点,深入研究了VP2009蛋白及其调控的目的基因的生理功能,阐明VP2009/2010通过感知肠道信号因子连四硫酸钠,促进副溶血弧菌在肠道定殖的分子机制。本论文的研究结果为今后进一步研究副溶血弧菌LuxR家族基因功能及其对细菌致病性的作用提供重要的实验基础与理论依据。