肝脏NAD+代谢通过调控肠道2型固有淋巴细胞维持肠道稳态的机制研究

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研究背景和目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎,是一种慢性且易复发的肠道疾病。临床研究发现患有慢性肝病的IBD患者肠道炎症更加严重,原发性硬化性胆管炎(Primary sclerosing cholangitis,PSC)与IBD密切相关,约70%的PSC病人同时患有IBD。因此,探究慢性肝病加重IBD的机制,将为临床治疗提供理论依据以及潜在靶点。固有淋巴细胞(Innate lymphoid cells,ILCs)是主要分布在黏膜的一类免疫细胞,ILCs在组织稳态维持以及对抗致病微生物感染中发挥重要作用。ILCs包括一型(ILC1)、二型(ILC2)和三型(ILC3)等亚群。其中ILC2通过分泌IL-13和IL-5帮助宿主对抗寄生虫感染。除此以外,ILC2分泌双调蛋白Areg促进组织损伤修复,对结肠炎的恢复起到了关键作用。在机体维持稳态及防御过程中,免疫细胞需要适应微环境的变化不断调整细胞状态,与此同时代谢系统也会发生相应改变,以保证免疫细胞所需能量及营养物质。其中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)作为重要的氧化还原辅酶在多个代谢反应中发挥关键功能,为免疫细胞活化提供大量的生物合成前体。NAD+通过接收糖酵解和TCA循环中的高能电子,转移至电子呼吸链的复合酶I,驱动氧化磷酸化,产生ATP。在哺乳动物中,肝脏从头合成NAD+,释放烟酰胺(Nicotinamide,NAM)至血液循环中,肠道NAD+拯救合成提供底物。本研究主要目的是探究慢性肝病加重IBD的机制。本课题从肝脏NAD+代谢出发,利用肝-肠轴探究NAD+代谢对肠道ILC2功能的影响,从代谢角度探究IBD过程中免疫调控机制,为ILC2代谢调控及IBD的临床治疗提供理论依据。研究方法与结果1.肝损伤加重结肠炎症状为探究基础性肝病对溃疡性结肠炎的影响,我们通过病例回顾,评估了溃疡性结肠炎合并肝病患者的肠镜病理评分,结果显示肝病患者UCEIS评分更高(P<0.05)。本试验构建小鼠四氯化碳(CC14)肝纤维化模型,探究肝损伤对小鼠实验性结肠炎的影响。结果显示,CC14注射6周,可显著提高血清AST(P<0.0001)和ALT浓度(P<0.0001),提高肝脏胶原和α-SMA表达,提示小鼠肝纤维化模型构建成功。我们进一步利用CCl4肝纤维化模型进行小鼠DSS实验性结肠炎造模,结果显示,DSS处理后,与对照组小鼠相比,CC14组小鼠体重显著降低(P<0.05),肠道长度缩短(P<0.0001),肠道病理评分提高(P<0.001),提示小鼠肝纤维化可加重小鼠结肠炎。2.小鼠肝纤维化损害肠道ILC2功能为探究肝纤维化加重肠道炎症的机制,实验利用流式分析术检测CC14处理对肠道免疫细胞组成的影响。结果显示,CC14处理显著降低肠道IFNγ+ T细胞比例(P<0.001),显著提高 Treg 细胞比例(P<0.001),显著降低 IL-5+ILC2(P<0.0001)、IL-13+ILC2(P<0.0001)和Areg+ILC2(P<0.0001)细胞比例。提示Areg+ILC2细胞比例的降低可能与肝病加重结肠炎有关。3.肝脏NAD+代谢紊乱损害肠道ILC2功能为探究肝脏NAD+代谢对肠道ILC2功能的影响,实验检测CC14处理后肝脏NAD+浓度,结果显示,与对照组相比,CC14处理显著降低肝脏NAD+浓度(P<0.05)。实验在构建CCl4肝纤维化模型的同时回补NAD+代谢关键产物NMN,检测NAD+代谢恢复对肠道ILC2功能的作用,并进行小鼠实验性结肠炎造模。结果显示,与CCl4组相比,回补 NMN 可显著提高 IL-5+ILC2(P<0.05)、IL-13+ILC2(P<0.05)和 Areg+ILC2(P<0.05)细胞比例。DSS造模后,回补NMN组可提高小鼠体重(P<0.05),增加肠段长度(P<0.001),降低肠道病理评分(P<0.0001)。提示肝纤维化能够紊乱机体NAD+代谢,损害肠道ILC2功能,加重结肠炎。4.NAD+补救合成通路维持肠道ILC2功能为进一步验证NAD+代谢对肠道ILC2功能的影响,实验分选肠道ILC2,利用NAD+合成通路关键酶的抑制剂处理分选的ILC2。结果显示,NAD+三条合成通路共同关键酶NMNAT 抑制剂 GTN 可显著抑制 ILC2 的 IL-5(P<0.01)、IL-13(P<0.01)和 Areg(P<0.05)表达。补救合成通路关键酶NAMPT抑制剂FK866可显著抑制ILC2的IL-5(P<0.0001)、IL-13(P<0.0001)和 Areg(P<0.0001)表达,且回补 NAMPT 产物 NMN可恢复其表达,而从头合成通路关键酶QPRT抑制剂和Preiss-Handler合成通路关键酶抑制剂对ILC2功能无影响,提示NAD+补救合成通路对ILC2功能维持至关重要。我们进一步构建了 ILC2特异性敲除NAMPT小鼠(Namptfl/fl Il5RFP-cre)结果显示,与野生型对照小鼠相比,Namptfl/fl Il5RFP-cre小鼠的大肠KLRG1+ILC2比例降低(P<0.05),KLRG1+ILC2数量降低(P<0.05),RFP+ILC2比例降低(P<0.05)。进一步证实NAD+补救合成通路能够维持肠道ILC2功能。研究结论综上,本研究通过对已肝纤维化的小鼠进行实验性结肠炎造模,从而确定了肝脏损伤扰乱机体NAD+代谢,损害肠道ILC2功能,最终加重小鼠结肠炎的机制,并提出肠道ILC2的功能维持依赖于NAD+补救合成通路的正常进行。
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