论文部分内容阅读
鸡毒支原体Mycoplasma gallisepticum)是重要的禽病原体之一,主要引起鸡的慢性呼吸道疾病和火鸡传染性窦炎。由于缺乏三羧酸循环途径中的很多酶,通过糖酵解途径获取能量对于这类缺乏细胞壁的微生物来讲就显得尤为重要。醛缩酶(adolase, FBA)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase, pykF)是糖酵解途径的两个关键酶之一,但它们在支原体中的功能尚不清楚,本文将开展其生物学功能的研究。1.醛缩酶的生物学功能研究根据已发表的鸡毒支原体醛缩酶基因序列,设计特异性的引物,以鸡毒支原体R1ow株基因组为模板,通过Overlap PCR点突变扩增鸡毒支原体fba基因,将fba克隆至pET28a(+)载体后进行序列测定和分析。结果表明,fba全长873bp,编码290个氨基酸。将构建的重组表达质粒pET28a-fba转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白rMGfba,大小约为33kDa。纯化蛋白并对蛋白进行酶活性检测,结果显示该酶在体外具有与阳性对照醛缩酶相同的催化功能。同时用该蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体。提取鸡毒支原体膜蛋白,Western-blot显示FBA多抗血清可与该膜蛋白发生特异性结合；免疫胶体金电镜结果进一步说明了FBA位于鸡毒支原体膜表面。同时表达荧光蛋白和FBA的E.coli-fba-gfp重组菌株可黏附禽DF-1细胞,且FBA多抗血清对支原体黏附宿主细胞的阻断率达42.68%,说明了醛缩酶可介导支原体黏附宿主细胞,这为进一步研究该酶的功能奠定了基础。2.丙酮酸激酶的生物学功能研究为了研究丙酮酸激酶的生物学功能,我们利用pET系统首先原核表达了该蛋白。将PCR扩增的pykF基因插入pET28a (+)载体构建重组表达质粒pET-pykF,将鉴定为阳性的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)构建重组菌E.coli-pykF,重组菌在IPTG诱导下成功获得融合蛋白rMGpykF,表达的蛋白经SDS-PAGE分离后用考马斯亮蓝染色,结果显示该蛋白大小约为60kDa,与预期结果相符。纯化蛋白并对蛋白进行酶活性检测,结果显示该酶具有与阳性对照丙酮酸激酶相同功能,都可催化NADH形成NAD+,说明鸡毒支原体中pykF基因编码丙酮酸激酶。用纯化的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,免疫印迹反应和免疫电镜结果都显示丙酮酸激酶存在于鸡毒支原体膜表面。同时用鸡毒支原体阳性血清孵育转印有表达丙酮酸激酶的E.coli-pykF全菌蛋白的NC膜,结果有阳性条带出现,说明丙酮酸激酶是一个免疫原性蛋白；补体介导的细胞毒试验显示丙酮酸激酶血清有66.16%的杀菌效率,说明该酶对机体可产生较好的免疫保护力。为了进一步探明作为膜蛋白的丙酮酸激酶的功能,构建了同时表达荧光蛋白和丙酮酸激酶的重组菌株E.coli-pykF-gfp,利用细菌感染DF-1细胞来体外模拟支原体感染细胞,结果显示只有表达丙酮酸激酶的阳性重组菌才能黏附DF-1细胞,且丙酮酸激酶多抗血清具有明显的阻断支原体黏附宿主细胞的作用,阻断率达39.13%,说明作为膜蛋白的丙酮酸激酶在支原体黏附宿主细胞的过程中可能发挥黏附作用。