精氨酸激酶（arginine kinase,AK）是磷酸激酶家族的成员,通过可逆催化将ATP的γ-磷酸基团转移到胍基化合物上生成磷酸化的胍基化合物和ADP,从而参与维持细胞内ATP稳态。由于精氨酸激酶不存在于哺乳动物中,并且作为昆虫体内唯一存在的磷酸原激酶在能量调控过程中具有重要作用,精氨酸激酶已成为开发新型高选择性杀虫剂和基于RNA干扰防治害虫的潜在靶标。目前关于昆虫精氨酸激酶的研究主要集中于分子克隆、体外表达和逆境胁迫下的mRNA水平分析等方面。本文以重要储粮害虫赤拟谷盗Tribolium castaneum为模式昆虫,在克隆赤拟谷盗两种精氨酸激酶基因全长cDNA的基础上,对TcAK1和TcAK2的时空表达模式、酶学性质和功能及其转录调控机制和磷酸化修饰进行分析。1.TcAK1和TcAK2的时空表达模式与亚细胞分布的比较分析利用 RT-PCR 和 cDNA 末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）分别获得1471 bp和1283 bp的TcAK1和TcAK2基因的cDNA全长序列,其中TcAK1的 5’-非翻译区（Untranslated region,UTR）长度为 52 bp,3’-UTR 长度为 351 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）长1068 bp,编码355个氨基酸残基;TcAK2 的 5’-UTR 长度 56 bp,3’-UTR 长度为 111 bp,ORF 长 1116 bp,编码 371 个氨基酸残基。氨基酸序列比对表明,TcAK1与TcAK2序列一致性为70.62%。系统发生分析表明,TcAK1和TcAK2分别属于昆虫群1 AK和群2 AK。利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析TcAK1和TcAK2在赤拟谷盗各发育阶段的表达情况,发现TcAK1和TcAK2分别在5日龄幼虫和1日龄雄性成虫的表达水平最高。与22日龄幼虫相比,TcAK1在1日龄预蛹和3日龄预蛹的表达水平分别显著下降1.4倍和2.3倍,TcAK2则显著上升99.1倍和593.4倍。对7日龄雌成虫不同组织部位的分析发现,TcAK1和TcAK2都在头部和胸部的表达水平较高。利用免疫荧光染色和不同细胞组分WB检测雌成虫中肠中TcAK1和TcAK2的亚细胞定位,发现TcAK1存在于包括线粒体在内的细胞质中,而TcAK2位于除线粒体外的细胞质中,TcAK1和TcAK2均未发现于细胞核中。2.TcAK1和TcAK2的体外表达和酶学性质的比较分析利用体外表达的重组TcAK1和TcAK2蛋白比较分析两种精氨酸激酶的酶学性质。对重组TcAK1和TcAK2蛋白的酶动力学分析发现,TcAK1对L-精氨酸（KmArg）和磷酸-L-精氨酸（KmP-Arg）的米氏常数分别为1.5 mM和14.0 mMTcAK2分别为3.7 mM和1.4 mM。TcAK1和TcAK2对L-精氨酸的kcat值分别为172.7 s-1和12.7 s-1,对磷酸-L-精氨酸的kcat值分别为22.0 s-1和146.1 s-1。利用不同胍基底物检测精氨酸激酶的底物特异性,结果显示TcAK1和TcAK2对L-精氨酸的特异性显著高于D-精氨酸。在所研究的其它潜在的胍基底物中,TcAK1对L-Nα-乙酰-精氨酸和L-刀豆氨酸的反应速率约为对L-精氨酸反应速率的15%,但TcAK2对其它底物几乎没有活性。3.TcAK1和TcAK2在生长发育过程中的功能及其对逆境胁迫的应激响应分析利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）分析TcAK1和TcAK2在赤拟谷盗在生长发育和繁殖过程中的作用。结果显示,dsTcAK1处理组虽然有85.4%的幼虫化蛹,但只有22.9%的蛹成功羽化,均显著低于对照组,而dsTcAK2处理对化蛹和羽化均没有显著影响。产卵量分析发现,与对照相比（WT为5.9卵/天/对,IB为5.6卵/天/对）,dsTcAK1处理导致产卵量显著降低（3.7个卵/天/对）,dsTcAK2处理无显著影响。dsTcAK1和dsTcAK2处理组F1代卵孵化率分别为17.8%和23.3%,显著低于对照组。利用正反交试验检测TcAK1和TcAK2对产卵量和卵孵化率影响的性别特异性。dsTcAK1处理雌虫和对照雄虫交配的产卵量为4.3个卵/天/对,dsTcAK1处理雄虫与对照雌虫交配的产卵量为4.0个卵/天/对;dsTcAK1注射组雌虫与对照组雄虫交配后卵孵化率为17.3%,dsTcAK1注射组雄虫与对照组雌虫交配后卵孵化率为23.0%。这些结果表明,TcAK1对产卵量和卵孵化率的影响与性别无关。dsTcAK2注射组雌虫与对照组雄虫交配后卵孵化率为24.1%,dsTcAK2注射组雄虫与对照组雌虫交配后卵孵化率为21.3%,表明TcAK2对卵孵化率的影响也与性别无关。利用RT-qPCR和western b1ot（WB）检测高温（42℃）、低温（4℃）以及百草枯处理诱导的氧化胁迫对TcAK1和TcAK2的mRNA和蛋白水平的影响。45℃高温处理结果显示,TcAK1和TcAK2的mRNA水平分别在处理后1 h和2 h上调665.0倍和150.6倍。4℃低温处理结果显示,TcAK1和TcAK2的mRNA水平分别在处理后12 h和4 h后上调3.1倍和35倍。WB检测发现,TcAK1的蛋白质水平在高温处理2 h,4 h和12 h后显著上升,TcAK2的蛋白质水平在高温处理4 h和12 h显著上升。TcAK1和TcAK2的蛋白质水平分别在低温处理4 h后以及2 h后显著上升。百草枯处理结果显示,TcAK1的mRNA水平为对照的3.3倍至4.4倍,并在2 h达到峰值,而TcAK2的mRNA水平为对照的1.4倍至2.6倍,并在12 h达到峰值。WB检测发现,TcAK1和TcAK2的蛋白质水平分别在百草枯处理1h和4h后显著上升。利用RNAi分析TcAK1和TcAK2在赤拟谷盗在耐受胁迫过程中的作用。dsTcAK1和dsTcAK2处理导致雌虫对高温和百草枯处理的耐受性均显著降低。高温处理条件下,dsTcAK1和dsTcAK2处理组雌虫平均存活时间分别为对照组的39.0%和52.5%;20 mM百草枯处理12 h后,dsTcAK1和dsTcAK2处理组雌虫存活率分别为3.3%和25%,显著低于WT组（43.3%）和IB组（34.8%）,但两种精氨酸激酶基因的敲减对低温的耐受性没有显著影响。4.蜕皮激素和保幼激素对TcAK1和TcAK2的转录调控机制利用RNAi和激素处理探讨蜕皮激素和保幼激素对TcAK1和TcAK2的转录调控。dsTcphantom和dsTcshade处理导致TcAK1的mRNA表达量显著升高,TcAK2的表达量显著降低;dsTcJHAMT和dsTcMet处理导致TcAK1的mRNA表达量显著降低,TcAK2的表达量显著升高。进一步使用保幼激素（Juvenile hormone Ⅲ,JH Ⅲ）和20-羟基蜕皮甾酮（20-Hydroxyecdysone,20E）处理20日龄幼虫发现,注射20E处理导致TcAK1的mRNA水平显著下调至少20%,而TcAK2的mRNA水平在处理30 min到4 h后显著上调。点滴JH Ⅲ处理导致TcAK1的表达量在处理后30 min到2 h显著增加,而TcAK2的mRNA水平在处理期间显著降低。WB实验进一步验证TcAK1和TcAK2蛋白质水平的变化。利用RT-qPCR、RNAi、双荧光素酶报告基因系统和电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）探讨转录因子 Broad-complex（BR-C）在激素调控TcAK1和TcAK2表达中的作用。20E处理诱导TcBR-C的mRNA表达水平,而JH Ⅲ处理抑制TcBR-C的mRNA表达水平。注射dsTcBR-C导致TcBR-C的mRNA水平降低65.1%,TcBR-C的敲减导致TcAK1的mRNA水平和蛋白质水平上调,但下调TcAK2的mRNA和蛋白质水平,同时TcBR-C的敲减消除了 20E和JH Ⅲ处理对TcAK1和TcAK2表达的影响。利用果蝇S2细胞进行双荧光素酶报告基因分析,发现与未转染TcBR-C过表达载体的空白对照相比,TcBR-C-z1,TcBR-C-z2,TcBR-C-z3,TcBR-C-z4和TcBR-C-z5的过表达分别抑制TcAK1启动子60.0%,89.8%,21.3%,61.5%和72.2%的活性,但是提高TcAK2启动子活性1.4倍,12.2倍,2.2倍,1.8倍和4.1倍。EMSA实验进一步证实TcBR-C-z2与TcAK1和TcAK2启动子在体外的直接结合。这些结果表明蜕皮激素及保幼激素对TcAK1和TcAK2表达的调控主要由TcBR-C-z2介导。5.氧化胁迫条件下AMPK-FOXO通路对TcAK1和TcAK2的转录调控机制利用腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）的激活剂AICAR分别处理草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（Sf9）细胞和赤拟谷盗以及RNAi和过表达探讨AMPK和TcAKs在维持氧化胁迫条件下ATP稳态的作用。结果显示,AICAR的处理在一定程度上降低百草枯处理诱导的ATP消耗。利用RNAi技术敲减TcAMPKα,TcAK1和TcAK2后虽然没有对ATP基础含量产生影响,但是均显著上调百草枯诱导的ATP消耗。TcAK1和TcAK2的敲减也显著降低百草枯处理条件下AICAR诱导的ATP含量稳定性。与对照组相比,在Sf9细胞中分别过表达TcAK1和TcAK2均显著抑制百草枯诱导的ATP消耗。这些结果表明,在氧化胁迫条件下,TcAMPK和TcAKs在维持ATP含量稳定过程中都具有重要作用,并且TcAMPK维持能量稳定的功能在一定程度上依赖于精氨酸激酶。利用RNAi和AICAR处理检测TcAMPK对TcAK1和TcAK2的转录调控作用。虽然TcAMPKα的敲减对TcAK1和TcAK2的基础表达没有影响,但是与注射dsEGFP的对照组相比,TcAMPKα的敲减使百草枯对TcAK1和TcAK2的诱导倍数分别从7.3倍和4.8倍下降到1.8倍和1.6倍。AICAR处理使TcAK1和TcAK2的基础mRNA水平分别上调2.7倍和3.4倍,并且显著增加百草枯诱导的TcAK1和TcAK2的上调倍数,分别从对照组的8.4倍和4.4倍上调至15.5倍和11.6倍。这些结果揭示在转录水平上,TcAMPK参与氧化胁迫下TcAK1和TcAK2的表达调控。利用RT-qPCR、WB、RNAi、免疫荧光和磷酸化水平检测技术研究转录因子叉头框蛋白O（Forkheadbox O,FOXO）在抗氧化胁迫过程中的作用。RT-qPCR检测显示百草枯处理导致TcFOXO的mRNA水平在2 h至8 h内至少上调2.1倍,WB试验也揭示其蛋白质水平的上调。RNAi敲减TcFOXO没有导致赤拟谷盗的死亡,但是导致百草枯处理12 h后生存率降低到10.0%,显著低于WT组56.7%的生存率和dsEGFP组65.2%的生存率。利用免疫荧光和不同细胞组分的WB检测发现,百草枯处理导致TcFOXO 在细胞核中聚集。利用 Pro-Q Diamond phosphoprotein gel stain kit 和phosphoprotein phosphate estimation kit检测发现氧化胁迫导致TcFOXO磷酸化水平显著上调。这些结果表明在氧化应激过程中,TcFOXO发生磷酸化并易位至细胞核中发挥转录调控的作用。利用 RNAi、双荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）-qPCR 分析 TcFOXO 对TcAK1和 TcAK2 的转录调控。敲减TcFOXO在mRNA水平上使TcAK1和TcAK2分别降低63.5%和47.4%。WB检测也发现敲减TcFOXO后TcAK1和TcAK2的蛋白表达水平也显著降低。注射dsTcFOXO使百草枯对TcAK1和TcAK2的诱导倍数从7.4倍和4.5倍下降到2.3倍和1.2倍。在Sf9细胞进行的双荧光素酶报告基因显示,与转染空白对照pIZT-Control相比,TcFOXO的过表达使TcAK1和TcAK2启动子驱动的荧光素酶活性分别上调4.4倍和4.1倍,而结合位点的随机突变使荧光素酶活性的上调倍数降低至2.3倍和1.9倍。ChIP-qPCR结果显示,与对照相比,百草枯处理使TcFOXO在TcAK1和TcAK2启动子上的富集倍数分别上升5.2倍和4.2倍。这些结果显示TcFOXO在氧化应激过程中对TcAK1和TcAK2的直接调控作用。利用RNAi、WB、磷酸化水平检测技术以及ChIP-qPCR分析TcAMPK介导的TcFOXO对精氨酸激酶的调控作用。结果显示TcAMPKα的敲减和AICAR的处理均不会影响TcFOXO的mRNA水平。TcAMPKα的敲减显著降低百草枯诱导的TcFOXO的磷酸化以及核易位,相反地,AICAR处理则显著上调TcFOXO的磷酸化水平以及核易位程度。利用双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complimentary,BiFC）和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）进一步确认 TcAMPKα和 TcFOXO之间的直接相互作用。ChIP-qPCR结果显示,与对照组相比,TcAMPKα的敲减导致TcFOXO在TcAK1和TcAK2启动子区的富集程度分别降低80.4%和85.3%。AICAR处理则导致TcFOXO在TcAK1和TAK2启动子区的富集程度分别上调3.6倍和3.3倍。这些结果表明,TcAMPK通过直接磷酸化TcFOXO以促进其在氧化胁迫条件下的核易位来增强TcFOXO在TcAK1和TcAK2启动子区域的富集以调控其表达。在人胚胎肾脏细胞（HEK293）细胞中同样发现氧化胁迫条件下AMPK-FOXO介导对哺乳动物的精氨酸激酶同系物—脑型肌酸激酶（Creatine kinase brain-type,CKB）的调控,这一结果揭示AMPK-FOXO-磷酸原激酶的调控通路在氧化胁迫响应中的作用及其保守性。6.TcAMPK对TcAK1和TcAK2的磷酸化修饰利用酵母双杂交（yeasttwohybrid,Y2H）、Co-IP、GST融合蛋白沉降（GSTpull-down）技术检测 TcAMPK 与两种精氨酸激酶的直接作用,发现 TcAMPKα 与TcAK1/TcAK2在体外和体内均会产生相互作用。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF MS/MS）和液相串联二级质谱（Liquid chromatography with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分析 TcAK1 和 TcAK2 中的 AMPK 依赖性磷酸化位点。使用重组TcAMPKαβy三聚体蛋白在体外直接磷酸化TcAK1和TcAK2,质谱分析显示,在TcAK1中有2个磷酸化位点,分别位于TcAK1的第129位丝氨酸（Ser129）和第247位苏氨酸（Thr247）,在TcAK2中有1个磷酸化位点,位于TcAK2的第145位丝氨酸（Ser145）。利用体外表达的模拟磷酸化突变体检测磷酸化后酶活性质的变化,结果显示,野生型TcAK1,突变体TcAK1 S129D和突变体TcAK1 T247D对于ATP的Km值与ADP的Km值的比值分别为0.05 mM、0.2 mM和1.2 mM。野生型TcAK2和突变体TcAK2 S145D对于ATP的Km值与ADP的Km值的比值分别为1.2和2.2。利用Pro-Q Diamondphosphoproteingel stainkit和Phosphoprotein phosphate estimation kit检测氧化胁迫条件下TcAMPK对TcAK1和TcAK2的磷酸化作用。结果显示,AICAR和百草枯处理均显著上调TcAK1和TcAK2的磷酸化水平。与对照组相比,TcAMPKα的敲减则显著削弱百草枯对TcAK1和TcAK2磷酸化水平的诱导,分别降低73.3%和69.1%。利用免疫沉淀的精氨酸激酶检测AICAR处理对体内精氨酸激酶活性的影响,结果显示,TcAK1和TcAK2对于ATP的Km值与ADP的Km值的比值分别从对照组的0.1和1.2增加为AICAR处理组的5.5和3.4。这些结果表明,TcAMPK直接作用于精氨酸激酶使其磷酸化,改变其催化活性,使其催化的可逆反应向着ATP合成的方向进行以快速响应能量的需求。7.TcAK1和TcAK2在赤拟谷盗对溴氰菊酯耐受性中的作用利用RT-qPCR检测溴氰菊酯对精氨酸激酶表达的诱导。在溴氰菊酯处理2 h后,TcAK1的mRNA水平上调2.1倍,并在12 h后恢复到对照组水平;在溴氰菊酯处理4 h后,TcAK2的mRNA水平上调2倍以上。利用RNAi和精氨酸激酶抑制剂测试精氨酸激酶在赤拟谷盗对溴氰菊酯耐受性中的作用,发现RNAi敲减TcAK1和TcAK2后,赤拟谷盗在溴氰菊酯处理后的中位生存时间从对照组的42.0h分别降低到24.3 h和28.7 h。使用两种精氨酸激酶抑制剂—芦丁和槲皮素的处理同样提高对赤拟谷盗对溴氰菊酯的敏感性,使中位生存时间分别降低38.5%和34.9%。这些结果表明精氨酸激酶可能通过维持能量稳态参与赤拟谷盗对溴氰菊酯的代谢作用。本文利用RNAi 比较分析昆虫2种精氨酸激酶的功能,结合双荧光素酶报告基因、EMSA、ChIP-qPCR、Y2H、GST pull-down、Co-IP和质谱分析阐明其转录调控和翻译后修饰调控机制,研究结果对于揭示昆虫AK基因的功能与调控机制具有重要的科学意义,同时也将为创制高选择性的杀虫剂以及利用表达AK基因dsRNA的转基因作物控制害虫提供理论依据。