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胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs）主要来源于胚胎囊胚期的内细胞团，具有分化的多潜能性和自我更新能力。转录因子调控网络和表观修饰调节，包括microRNA（miRNA）调控，在ESC的多能性维持和分化调节中都发挥着重要的作用。2010年，研究发现维生素C能促进诱导干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）产生，此后维生素C在诱导细胞重编程和ESCs调控领域的研究引起了广泛关注。研究表明，维生素C有利于促进ESCs多能性维持，改善iPSC的诱导效率以及提高iPSC的重编程质量。目前研究表明，维生素C主要调控干细胞的表观修饰，包括DNA甲基化和组蛋白修饰等。本研究以小鼠胚胎干细胞J1（J1mESCs）和小鼠畸胎瘤细胞系F9为研究对象，结合转录组表达谱芯片分析、miRNA测序分析以及实验验证等方法，探索维生素C调控干细胞多能性维持的作用机理。1.维生素C促进无饲养层J1mESCs的自我更新和克隆形态。在无LIF的干细胞培养液中培养J1mESCs，加入维生素C后，J1mESCs的克隆形态变大，碱性磷酸酶（alkalinephosphatase, AP）活性升高。而维甲酸（retinoic acid, RA）诱导分化后，J1mESCs克隆形态明显变小，周围出现大量分化细胞，AP活性也显著降低。重新加入维生素C后，干细胞克隆形态明显恢复，AP活性也恢复较高水平。表明维生素C有助于促进干细胞的自我更新，并能够拮抗RA诱导的干细胞分化。2.维生素C能够促进小鼠J1mESCs多能性基因的表达，并下调一些与分化相关的细胞信号转导途径。a）基因表达谱芯片证实维生素C有利于小鼠J1mESCs多能性基因表达。收集维生素C处理的J1mESCs，进行基因表达谱芯片分析，以寻找维生素C的下游调控基因。利用在线软件DAVID（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）对实验数据进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes）分析，结果发现，维生素C广泛促进多能性基因的表达，其中包括Esrrb、Utf1、Klf4、Tcl1、Eras、Nanog等重要的多能性因子，同时下调分化相关转录因子的表达。上述结果得到实时定量PCR（qPCR）的验证。b）维生素C激活核心多能性基因转录。分别构建小鼠Nanog、Oct4、Sox2、Klf4基因近端启动子萤光素酶报告载体，检测维生素C处理对这些启动子活性的影响。结果发现，维生素C能促进Nanog和Oct4近端启动子活性上升。同时qPCR和Western Blot验证表明，维生素C能够促进Nanog基因表达上升。c）维生素C下调部分与细胞分化相关的信号转导途径。采用信号通路报告载体转染J1mESCs和小鼠F9细胞，加入维生素C后检测信号通路效应元件的变化。结果发现，维生素C下调NF-κB、JNK、Myc等与细胞凋亡、分裂、周期调控相关的细胞信号转导途径。3.维生素C促进mESC中特异性miRNA的表达，并通过miRNA介导的基因表达调控，抑制与细胞分化和发育相关基因。a） miRNA深度测序结果表明维生素C能促进mESC中特异性miRNAs的表达。收集维生素C处理的J1mESCs，在Illumina HiSeq2000平台上进行小RNA深度测序分析。结果发现，维生素C促进干细胞中miRNA整体表达水平，发生显著变化的miRNAs中，超过70%被上调，尤其是干细胞特异性miRNA簇，包括miR-290–295、miR-17–92、miR-106b–25等，许多Dlk1-Dio3印记区编码的miRNAs也能被维生素C显著上调，包括miR-143、miR-434、miR-540、miR-433等，而与分化相关的miRNAs表达则下调，如miR-470。上述结果得到miRNA qPCR的验证。b）筛选上述实验中维生素C上调的miRNAs，利用在线软件TargetScan预测靶标，并进行GO分析，发现这些靶标主要富集于调控细胞分化与发育相关途径。筛选miR-296,miR-361, miR-143, miR-331, miR-434部分靶标，利用双萤光素酶报告检测miRNA对靶标抑制作用以及qPCR验证靶标mRNA表达水平。结果表明，预测到的11条靶标序列，其中有9条能被相应的miRNAs抑制，同时，qPCR检测的4个靶基因mRNA水平，其中3个靶基因表达显著下调。说明预测具有较高的准确性，预测结果可以反映出miRNA的调控作用。c）维生素C上调miR-296, miR-361, miR-143, miR-331, miR-434的表达，维生素C下调Kdm6b、Sox6、Klf13、Sox17等与调控发育相关基因，同时，这些上调的miRNA靶向抑制这些下调的基因。上述结果表明，维生素C通过介导miRNA表达抑制干细胞中与分化和发育相关的基因。4.维生素C介导miRNA调控干细胞DNA去甲基化修饰。a）维生素C介导miR-143抑制干细胞中Dnmt3a表达。在J1mESCs中过表达miR-143后，发现J1mESCs AP活性显著升高，核心多能性基因Oct4、Klf4、Esrrb表达也显著升高，表明miR-143能够促进J1mESCs的自我更新。维生素C上调miR-143的表达，qPCR和Western Blot检测发现，维生素C和miR-143都能显著抑制Dnmt3a的表达，而用miR-143抑制物干扰内源性miR-143表达后，维生素C不再抑制Dnmt3a的表达，上述结果表明，维生素C通过介导miR-143来抑制干细胞中Dnmt3a的表达。b）维生素C促进多能性基因及干细胞特异性miRNA簇启动子区去甲基化。收集维生素C处理的J1mESCs，提取基因组，进行甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）检测，结果发现，维生素C处理后，多能性基因Tbx3、Tcl1和Esrrb及干细胞特异性miRNA簇（miR290-295和miR17-92）启动子区甲基化水平明显降低。表明维生素C对干细胞中基因启动子区有比较广泛地去甲基化效应，Dnmt3a是干细胞中重要的DNA甲基化酶，维生素C的去甲基化效应可能与其抑制Dnmt3a表达有关。c）维生素C促进Tet1表达，并促进Dlk1-Dio3印记区域基因间差异甲基化区域（intergenic differentially methylated region, IG-DMR）的羟甲基化水平。维生素C处理J1mESCs后，能够促进Tet1表达上调并拮抗RA的抑制作用。同时，羟甲基化水平检测表明，维生素C处理后，多能性基因和干细胞特异表达的miRNA簇启动子区羟甲基化水平没有显著变化，Dlk1-Dio3印记区域IG-DMR的羟甲基化水平有显著上升，可能说明，印记基因区Dlk1-Dio3的去甲基化与羟化酶作用密切相关，维生素C可能通过上调Tet1表达促进其羟甲基化水平。综合以上结果，本研究揭示维生素C通过调节干细胞中的转录因子和miRNA表达促进胚胎干细胞多能性维持，为维生素C在胚胎干细胞以及诱导多能性干细胞领域中的应用提供了理论基础。