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机体异常脂质积累是导致肥胖的明确证据之一。而肥胖是一种多器官特异性变化的疾病,会大大增加患者得心脑血管类病、2型糖尿病、高血压和肿瘤等病的危险性。且随着肥胖发病率的上升,开发潜在的临床疗法和药物以改善肥胖和治疗肥胖相关疾病已经成为重点研究方向。绞股蓝作为传统中药,具有广泛生理活性,其中降脂活性作为绞股蓝主要功效,因此绞股蓝在降脂减肥方面有较高潜在价值。但现存研究还尚未明确绞股蓝降脂减肥的物质基础及作用机制,这在一定程度限制了绞股蓝及其活性成分的综合利用开发。近年来,蓬勃发展的生物网络药理学研究为跨越中西医之间的鸿沟搭建了桥梁,它通过解析“疾病网络”,鉴定并调节疾病网络中的“关键节点”来重构生物网络中平衡的观念,为药理学与新药研究工作者提供了启迪。根据此观点,本研究采取了网络药理学的科研思维与方式,通过使用一些生物学信息数据库、分子对接技术,分析预测绞股蓝降脂活性成分与其作用机制,接着采用半仿生提取法提取绞股蓝总皂苷,测定其降脂及抗氧化活性,并使用液质联用技术分析组成成分,最后结合网络药理学预测结果,在两种细胞模型上探究并验证绞股蓝中活性成分降脂作用及机制。(1)绞股蓝防治肥胖的物质基础、作用靶点及通路预测通过网络药理学及分子对接技术预测出绞股蓝防治肥胖物质基础可能为人参皂苷F2、槲皮素、3-甲基鼠李素、绞股蓝皂苷ⅩⅩⅧ等16个化合物,这些活性成分通过作用于STAT3、AKT1、VEGFA、SRC、EGFR、MAPK3等107个治疗肥胖靶点,调节如PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、胰岛素抵抗等通路,调节机体脂肪细胞增殖分化、糖脂代谢及机体稳态等多方面实现肥胖防治作用。分子对接结果显示,PPI中度值前6位核心靶点与相对应化合物人参皂苷F2、槲皮素、绞股蓝皂苷ⅩⅩⅧ、3-甲基柔二醇,a-菠菜甾醇等8个化合物对接相互作用能量分数在-22.8832~-49.6606,表明这8个化合物与对应核心靶点蛋白结合普遍较好,提示本实验的预测结果具有较高的参考价值。(2)绞股蓝半仿生法提取物降脂、抗氧化活性及成分分析在单因素实验及响应面优化实验对第一次提取液pH 1、第二次提取液pH2、料液比、提取温度、提取时间进行考察,得出绞股蓝半仿生法提取总皂苷的最佳工艺参数为:pH 1为2.9、pH 2为7.6,料液比为1:20 g/mL,提取时间60 min,提取温度45℃,所得绞股蓝皂苷得率为2.36%。通过对半仿生法绞股蓝总皂苷提取物的体外降脂及抗氧化实验显示绞股蓝总皂苷对胆酸盐有一定吸附能力,对DPPH·及·OH具有一定清除能力,表明绞股蓝总皂苷提取物具有体外降脂及抗氧化活性。采用UPLC-MS/MS对绞股蓝总皂苷中化合物进行分析,其中分析出网络药理学筛选出的关键降脂成分人参皂苷F2(GF2),基于此之后实验将围绕GF2,参考网络药理学筛选靶点,研究其降脂作用及机制。(3)基于3T3-L1脂肪细胞分化模型探讨GF2对脂肪生成作用影响通过油红染色及TG、TC生化指标结果显示,与control组相比,MDI组细胞内脂滴积累明显,表明3T3-L1脂肪细胞分化模型构建成功。与MDI组相比,GF2组能显著降低(p<0.05)细胞内油红染色面积及TC、TG水平;采用qRT-PCR及Western Blot实验结果显示GF2在一定浓度下不仅可以抑制网络药理学筛选出的靶点STAT3、VEGFA、FGF2表达水平,而且也可抑制脂肪细胞分化关键靶点PPARγ、cEBPα、cEBPβ的表达水平,一定程度上调控了脂肪细胞分化及脂质积累,提示GF2在绞股蓝发挥防治肥胖中可能是通过降低脂肪细胞成脂分化能力,达到减肥降脂的目的。(4)基于HepG2细胞脂堆积模型研究GF2对肝细胞脂质代谢能力影响使用油酸诱导的HepG2细胞脂堆积模型研究GF2降脂能力及机制。首先考察出当油酸浓度大于300 μM而小于600 μM时,对细胞存活无影响且细胞内脂滴量随浓度逐渐增加,由于用400~600 μmol/L油酸诱导时,各浓度组间脂滴量无显著性差异,故选择400 μmol/L为实验油酸诱导剂量。接下来分别设置control组、OA组及GF2的低中高剂量组。油红染色及TC、TG实验结果显示,与OA组相比,GF2组能显著降低(p<0.05)油红染色面积及TC、TG水平,降低细胞内脂质堆积量。GF2对高脂HepG2细胞中ROS、MDA、SOD影响结果显示,与OA组相比,GF2组能显著降低油酸诱导下HepG2细胞中ROS及MDA的产生,提高SOD水平,推断GF2可以通过提高细胞抗氧化能力,抑制脂质过氧化从而达到保护细胞正常代谢功能,缓解脂质积累的作用。并在分子水平上,通过对靶点PPARγ、cEBPβ、STAT3基因mRNA及蛋白表达的抑制作用,来降低细胞脂质堆积程度。本课题使用网络药理学探讨了绞股蓝中降脂减肥活性成分及潜在治疗靶点,并结合分子对接及体外细胞实验对绞股蓝中降脂活性成分GF2及其作用机制进行探究。结果表明,GF2可能为绞股蓝中关键降脂成分,其在一定浓度下可降低细胞内脂质含量,通过调控参与细胞分化的血管生成因子VEGFA、FGF2及脂肪细胞分化成脂关键靶点STAT3、PPARy、cEBPα、cEBPβ表达水平,抑制了 3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化及细胞内脂滴形成;不仅如此,GF2在一定浓度下可降低油酸诱导的HepG2细胞内脂质水平,降低机体内ROS、MDA水平,提高机体SOD水平,改善由脂质积累引起的的氧化应激反应,并在分子水平上调控STAT3、PPARy、cEBPβ基因及蛋白表达水平调节细胞内脂质积累程度,提高了肝细胞的脂质代谢能力。