NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱研究目的：1.从NCI-H929细胞系中分选CD20+和CD20-细胞，明确两种细胞克隆形成能力及分化能力的差异。2.探讨CD20+和CD20-的NCI-H929细胞蛋白表达谱的差异，验证其在mRNA和蛋白水平上的表达。3.选择影响CD20+细胞增殖的关键差异蛋白，抑制其功能，探讨对CD20+细胞增殖能力的影响。研究方法：1. CD20+和CD20-的NCI-H929细胞分选取对数生长期的NCI-H929细胞，制备单细胞悬液，每107个细胞加免疫磁珠分选缓冲液80μl，随后加阻断剂20μl，4-8℃孵育10min，然后加CD20磁珠抗体20μl，4-8℃孵育15min，免疫磁珠分选缓冲液清洗细胞，将免疫磁珠抗体孵育的细胞加入免疫磁珠分选MS柱中，分选CD20+和CD20-细胞。采用流式细胞仪检测NCI-H929细胞和分选后的CD20+和CD20-细胞的免疫表型。2. CD20+和CD20-细胞的克隆形成及分化能力取分选的CD20+和CD20-细胞，制备细胞悬液，培养于细胞克隆培养基中，培养基中细胞终浓度为1×10³/mL，置入37℃5%CO₂培养箱中培养，14-21天后观察细胞克隆数，40个细胞记为1个克隆，计算形成率，检测CD20+和CD20-细胞的克隆形成能力。取克隆形成细胞，制成细胞悬液，重新接种于克隆培养基中，检测克隆形成情况，根据上述方法，再进行3次重新接种，观察实验细胞的自我更新能力。取分选的CD20+NCI-H929细胞，加入培养基中，置于孵箱中培养，2周后，收集培养细胞，制成细胞悬液，分别加入抗人CD20、CD45、CD38和CD138抗体，流式细胞术的方法检测CD20+细胞抗原表达。3.差异蛋白筛选取分选的CD20+和CD20-细胞，总蛋白试剂盒提取细胞总蛋白，加入12%SDS-PAGE凝胶中进行电泳，将两组的蛋白质胶图进行分析后，将各组的所有条带分为10部分切下，每块切成直径2mm的小粒。萃取胶粒中蛋白质，使用胰酶溶液进行酶解，获得肽段干粉。TMT标记后，应用高效液相色谱分离与质谱鉴定两组间差异蛋白，Sequest软件鉴定筛选的差异蛋白。选取筛选的差异蛋白，应用在线数据库PANTHER （http://www.pantherdb.org/）对差异蛋白进行分类，应用人生物信息数据库STRING9.05（http://string-db.org/）分析差异蛋白之间的相互作用，筛选对CD20+细胞生物学特性具有重要影响的蛋白质。4.差异蛋白验证选取质谱鉴定出的差异蛋白，分别利用Real-time PCR和Western Blot的方法在mRNA和蛋白水平上验证差异蛋白的表达水平。收集CD20+和CD20-细胞，提取细胞总RNA，利用Real time PCR的方法从mRNA水平验证质谱鉴定的差异蛋白的表达；提取CD20+和CD20-细胞总蛋白，利用Western Blot方法从蛋白水平上验证质谱鉴定的差异蛋白的表达。5.差异蛋白功能对细胞增殖的影响根据生物信息学分析结果及文献报道，选择影响细胞增殖的差异蛋白质，利用差异蛋白Silencer siRNA和抑制剂干扰其功能，检测差异蛋白功能抑制后，CD20+和CD20-细胞增殖能力的变化，研究差异蛋白对CD20+细胞增殖能力的作用。结果：1. CD20+和CD20-的NCI-H929细胞分选用流式细胞术检测H929细胞抗原表达发现，H929细胞表达CD38、CD138，不表达CD45；CD20+细胞的比例很低，且不稳定，约为0.1-1%，CD20-的骨髓瘤细胞的比率约为99-99.9%。分选的CD20+细胞表达CD20、CD45和CD38，CD138表达减弱。分选的CD20-细胞表达CD38、CD138，不表达CD20、CD45。2. CD20+和CD20-细胞的克隆形成及分化能力CD20+和CD20-细胞克隆在培养箱中培养2周后，CD20+细胞形成明显的细胞集落，但CD20-细胞的增殖能力较弱，形成较小的集簇。将CD20+细胞形成的克隆用培养基稀释，离心，制成细胞悬液，重新接种，再次进行克隆实验。在CD20+细胞形成的克隆细胞中，大部分细胞克隆再形成能力较弱，但仍有部分细胞可再次形成较大集落。但是，CD20-细胞进行连续传代培养后，逐步失去克隆形成能力，没有细胞可形成较大集落。取分选的CD20+NCI-H929细胞，加入培养基中，置于孵箱中培养，2周后，收集培养细胞，制成细胞悬液，分别加入抗人CD20、CD45、CD38和CD138抗体，流式细胞术的方法检测H929细胞抗原表达。结果CD20+细胞培养后，CD20和CD45分子表达明显减低， CD38，CD138表达增强，细胞免疫表型恢复至典型的NCI-H929免疫表型状态。3.差异蛋白筛选选取分选的CD20-和CD20+细胞，进行质谱分析，共鉴定出1082种蛋白质，658种蛋白表达的差异超过1.5倍，与CD20-细胞相比，CD20+细胞中，205种蛋白表达上调，453种蛋白表达下调。PANTHER类别分析显示，差异蛋白参与的生物学过程主要有细胞通讯、转运、凋亡、系统过程、刺激应答、发育、代谢、细胞周期、免疫和黏附。差异蛋白参与最多的生物学过程是代谢（67.30%）、细胞进程（celluar process）（30.00%）和转运过程（17.98%）。与表达下调的差异蛋白相比，表达上调的蛋白中，参与细胞通讯、转运和细胞黏附的蛋白比例较高，参与其他生物学过程的蛋白比例较低。STRING相互作用分析显示，658种差异蛋白中，405种蛋白可与其它蛋白存在相互作用，其中60种蛋白形成核心网络，每种蛋白含有30个以上的节点，主要参与能量代谢、核苷酸合成和细胞增殖等维持细胞生命活动的过程。STRING分析74种参与细胞增殖、凋亡、代谢等信号通路的差异蛋白质，结果显示，61种蛋白可与其它蛋白存在相互作用，主要分为能量代谢、核苷酸合成代谢、泛素-蛋白酶体信号通路、细胞黏附转移和FAS信号通路5类蛋白。将目前文献报道的与细胞增殖密切相关的11种蛋白质联合74种差异蛋白进行分析，结果显示，75种蛋白存在相互联结，同样可形成5类蛋白群，同时TP53、AKT1、HSPA8等蛋白可于蛋白群形成密切联结，调控细胞的生命活动。4.差异蛋白表达验证从差异表达的658种蛋白质中，选择质谱分数大于20的15种蛋白质，同时选择6种与细胞增殖密切相关，但质谱未鉴定出的蛋白质，利用Real-time PCR的方法验证其在CD20+和CD20-细胞中的表达。Real-time PCR验证的基因表达变化与质谱鉴定的结果一致。选择上述21种蛋白质中与细胞增殖密切相关的13种蛋白，利用Western Blot的方法验证其在CD20+和CD20-细胞中的表达，Western Blot验证的基因表达变化与质谱鉴定的结果一致。5. RNA干扰联合mTOR抑制剂对细胞的增殖抑制作用CD20+细胞中，NANOG及SOX2基因表达增高，利用携带NANOG及SOX2干扰序列的慢病毒感染骨髓瘤细胞，表达特异性干扰RNA，降低NANOG及SOX2基因表达，检测其对骨髓瘤细胞增殖的影响。利用MTT的方法检测NANOG SilencerRNA、SOX2Silencer RNA及mTOR抑制剂RAD001对CD20+和CD20-细胞增殖的影响。结果发现，NANOG Silencer RNA及SOX2Silencer RNA不能有效抑制CD20+和CD20-细胞增殖，RAD001对CD20+细胞的增殖较抑制作用较NANOG SilencerRNA和SOX2Silencer RNA强，但无统计学意义，RAD001对CD20-细胞的增殖较抑制作用较NANOG Silencer RNA和SOX2Silencer RNA明显增强。三种药物联合应用后，CD20+和CD20-细胞的增殖受到明显抑制。结论：1.分选NCI-H929细胞中含有极少量CD20+细胞，其克隆形成能力较CD20-细胞强，具有自我更新和分化能力。2. CD20+细胞与CD20-细胞具有不同的蛋白表达谱，差异蛋白参与的生物学过程主要有细胞通讯、转运、凋亡、系统过程、刺激应答、发育、代谢、细胞周期、免疫和黏附，相互之间形成密切网络。3.利用CD20+细胞中表达增强的NANOG及SOX2干扰siRNA并不能有效抑制CD20+及CD20-细胞的增殖，联合mTOR抑制剂--RAD001后，CD20+和CD20-细胞的增殖受到明显抑制。