目的:通过建立小鼠肾缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)模型,观察自噬诱导和非诱导状态下肾IRI中肾组织病理学、超微结构、肾功能、自噬基因及自噬相关蛋白表达量的变化,以及高压氧(hyperbaric oxygenation,HBO)治疗对其表达的影响。探讨肾IRI中自噬的发生发展、信号转导及其对肾功能等的影响,进一步阐明自噬在肾IRI中的作用以及HBO治疗对自噬的影响。方法:将C57BL/6小鼠随机分为非自噬诱导组(非雷帕霉素处理)和自噬诱导组(雷帕霉素预处理)两个大组。每组又分为正常对照组、假手术组、肾缺血组、HBO+肾缺血组、肾IRI组、肾IRI+HBO组,然后再将假手术组、肾IRI组及肾IRI+HBO组分为1h、3h、6h、12h、24h组,每组6只小鼠。其中,自噬诱导组所有小鼠均于肾缺血和肾IRI模型建立前1h行雷帕霉素预处理。正常对照组仅切开腹腔后立即切取双肾及采血。假手术组切开腹腔,双侧肾蒂不阻断,分别在1h、3h、6h、12h、24h时切取双肾并采取静脉血。肾缺血组为切开腹腔后,双侧肾蒂阻断45min,后切取双肾并采取静脉血。HBO+肾缺血组为小鼠经HBO预处理1h后切开腹腔,双侧肾蒂阻断45min,切取双肾并采静脉血。肾IRI组为切开腹腔,双侧肾蒂阻断45min后开放血流,分别于再灌注后1h、3h、6h、12h、24h切取双肾并采取静脉血。肾IRI+HBO组为切开腹腔,双侧肾蒂阻断45min后开放血流,分别于再灌注后0h、2h、5h、11h、23h时行HBO治疗,HBO治疗1h后切取双肾并采取静脉血。采用HE染色观察肾组织的病理改变,透射电镜观察细胞超微结构及检测自噬体,免疫组化法检测Beclin-1、LC3-II、Atg-4、PKC及PI3K-III蛋白的表达,Western blot检测LC3-II蛋白的表达以及全自动生化分析仪检测血清肌酐(SCr)。结果:1.肾功能变化(1)在非雷帕霉素和雷帕霉素组均可见假手术组SCr值与正常对照组无显著差异;肾缺血组SCr值显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01);HBO+肾缺血组SCr值显著低于肾缺血组(P<0.05),但显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01);肾IRI组SCr值各时间点显著高于肾缺血组、正常对照组和假手术组(P<0.01);肾IRI+HBO组SCr值各时间点显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01),肾IRI+HBO组SCr值于1h、3h、6h显著低于肾IRI组(P<0.01);肾IRI组内和肾IRI+HBO组内各时间点SCr值有显著差异(P<0.05),且随着时间延长,SCr值逐渐增加,于24h达最高。(2)在非雷帕霉素和雷帕霉素组组之间:非雷帕霉素肾IRI组和肾IRI+HBO组于1h、3h、6h、12h时SCr值显著低于雷帕霉素组(P<0.05),其余雷帕霉素组的各组SCr值与非雷帕霉素组无显著差异。2.肾组织病理变化非雷帕霉素和雷帕霉素组均可见正常对照组和假手术组各时间点肾组织结构正常。肾缺血组见肾小管间质轻度出血,肾小球毛细血管攀轻度淤血,肾小管轻度肿胀。自噬诱导后,肾小管间质出血及肾小球毛细血管攀淤血明显,可见少量肾小管上皮细胞坏死脱落碎片。经HBO预处理后肾小球及肾小管间质未见明显出血,余与肾缺血组镜下观察无显著差别。肾IRI组1h、3h可见肾小管肿胀,部分肾小管管腔消失,肾小管管腔内可见少量上皮细胞坏死脱落碎片,胞浆颗粒样变性,肾小管间质出血,随着时间延长病变逐渐加重,12h时可见部分肾小管上皮细胞坏死脱落,24h时可见大片状肾小管上皮细胞坏死脱落,同时可见大量的红细胞管型,皮髓交界处最明显。自噬诱导后,可见大片肾小管上皮细胞坏死脱落,蛋白管型增多。经HBO治疗后肾小管细胞肿胀和间质出血以1h最明显,3h、6h病变较肾IRI组减轻,出血随着时间延长逐渐减轻,12h、24h时肾小管上皮细胞坏死和肾小球毛细血管攀淤血较肾IRI同时间点减轻,但肾小管间质出血较肾IRI对应时间点重,出血以髓质明显,肾小球囊腔可见纤维素样物质渗出,红细胞管型较少。3.透射电镜观察自噬体的变化在非雷帕霉素和雷帕霉素组均可见正常对照组和假手术组各时间点肾组织结构正常,其间偶可见少量自噬体形成。肾缺血性损伤后可见部分线粒体稍肿胀,膜结构不清晰,自噬体数量较正常对照组和假手术组增多,余镜下观察与正常对照组和假手术组无显著差别。自噬诱导后,病变镜下观察无差别,自噬体数量增多,经HBO预处理后,自噬体数量进一步增加。肾IRI组可见大量的自噬泡和自噬体形成,双层膜结构的自噬体明显,自噬体包裹的线粒体及蛋白质清晰可见,可见脂肪变性的脂滴形成,6h组可见自噬体最多,肾小管上皮细胞微绒毛失去膜型结构,但轮廓尚可辨,线粒体稍肿胀,溶酶体少见。12h和24h时自噬体逐渐减少,肾小管上皮细胞游离面微绒毛逐渐消失,线粒体肿胀,部分嵴断裂,可见少量次级溶酶体,肾小管基底膜不清晰,核膜出现皱褶且不清晰,病变以24h最显著。自噬诱导后,对应时间点自噬体数量增加,病变加重。经HBO治疗后自噬体数量进一步增加,12h和24h时自噬体仍较多,但病变减轻,病变仍以24h显著。4.免疫组化法检测肾组织Beclin-1、LC3-II、PI3K-III、PKC以及Atg-4的表达变化:(1)Beclin-1:主要表达于肾小管上皮细胞胞浆,少量表达于肾小球。相对定量结果显示:(1)在非雷帕霉素和雷帕霉素组均可见正常对照组、假手术组及肾缺血组之间Beclin-1蛋白表达量无显著差异,HBO+肾缺血组Beclin-1蛋白表达量显著低于正常对照组、假手术组及肾缺血组(P<0.01)。在非雷帕霉素肾IRI组于6h、12h时Beclin-1蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组及肾缺血组,而在雷帕霉素肾IRI组于1h、3h、6h时Beclin-1蛋白表达量高于正常对照组、假手术组及肾缺血组(P<0.01)。在非雷帕霉素肾IRI+HBO组于1h、3h时Beclin-1蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组及肾IRI组(P<0.01),于12h、24h时Beclin-1蛋白表达量显著低于肾IRI组(P<0.01)。雷帕霉素肾IRI+HBO组于1h、24h时Beclin-1蛋白表达量显著低于正常对照组、假手术组,6h时显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01),肾IRI+HBO组于1h、3h、6h时Beclin-1蛋白表达量显著低于肾IRI组(P<0.01)。在非雷帕霉素和雷帕霉素假手术组内各时间点Beclin-1蛋白表达量无显著差异,肾IRI组内和肾IRI+HBO组组内3h、6h、12h、24h时Beclin-1蛋白表达量均有显著差异(P<0.01),且随着时间的延长,Beclin-1蛋白表达量逐渐升高,于6h达最高,后随着时间延长逐渐降低。(2)在非雷帕霉素和雷帕霉素之间:雷帕霉素正常对照组、假手术组Beclin-1蛋白表达量与非雷帕霉素组无显著差异,雷帕霉素肾缺血组和HBO+肾缺血组Beclin-1蛋白表达量显著高于非雷帕霉素组(P<0.01),雷帕霉素肾IRI组、肾IRI+HBO组均于1h、3h、6h Beclin-1蛋白表达量显著高于非雷帕霉素组(P<0.01),12h、24h Beclin-1蛋白表达量显著低于非雷帕霉素组(P<0.01)。(2)LC3-II:主要表达于肾小管上皮细胞胞浆,少量表达于肾小球。相对定量结果显示:(1)在非雷帕霉素和雷帕霉素组均可见假手术组LC3-II蛋白表达量与正常对照组无显著差异。在非雷帕霉素正常对照组、假手术组及肾缺血组之间LC3-II蛋白表达量无显著差异,在雷帕霉素肾缺血组LC3-II蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01)。在在非雷帕霉素和雷帕霉素HBO+肾缺血组LC3-II蛋白表达量均显著高于正常对照组、假手术组及肾缺血组(P<0.01);肾IRI组LC3-II蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组及肾缺血组(P<0.01),肾IRI+HBO组LC3-II蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组及肾IRI组(P<0.01);假手术组内各时间点LC3-II蛋白表达量无显著差异;肾IRI组内和肾IRI+HBO组内随着时间延长LC3-II蛋白表达量逐渐降低,于3h达最低,后随着时间延长逐渐增加,于24h达最高(P<0.01)。(2)在非雷帕霉素和雷帕霉素之间:雷帕霉素各组及对应时间点组LC3-II蛋白表达量均显著高于非雷帕霉素组(P<0.01)。(3)PI3K-III:主要表达于肾小管上皮细胞胞浆。相对定量结果显示:(1)在非雷帕霉素和雷帕霉素组均可见假手术组PI3K-III蛋白表达量与正常对照组无显著差异;肾缺血组PI3K-III蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01)。在非雷帕霉素HBO+肾缺血组PI3K-III蛋白表达量与正常对照组、假手术组无显著差异。在雷帕霉素HBO+肾缺血组PI3K-III蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01)。在非雷帕霉素HBO+肾缺血组PI3K-III蛋白表达量显著低于肾缺血组(P<0.01)。在雷帕霉素HBO+肾缺血组PI3K-III蛋白表达量与肾缺血组无显著差异。在在非雷帕霉素和雷帕霉素肾IRI组于6h、12h时PI3K-III蛋白表达量显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01),而非雷帕霉素肾IRI组于1h、24h显著低于肾缺血组(P<0.01),于6h时PI3K-III蛋白表达量显著高于肾缺血组(P<0.01)。雷帕霉素肾IRI组于1h、3h、6h时PI3K-III蛋白表达量显著低于肾缺血组,于12h、24h时PI3K-III蛋白表达量显著高于肾缺血组(P<0.01)。非雷帕霉素肾IRI+HBO组于3h、6h、12h时PI3K-III蛋白表达量显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01),IRI+HBO组PI3K-III蛋白表达量与肾IRI组无显著差异。雷帕霉素肾IRI+HBO组PI3K-III蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组及肾IRI组(P<0.01)。在非雷帕霉素和雷帕霉素组假手术组内各时间点PI3K-III蛋白表达量无显著差异,肾IRI组内和肾IRI+HBO组内各时间点PI3K-III蛋白表达量有显著差异(P<0.01)。(2)在非雷帕霉素和雷帕霉素组之间:雷帕霉素正常对照组、假手术组及肾缺血组PI3K-III蛋白表达量显著低于非雷帕霉素组(P<0.01),雷帕霉素HBO+肾缺血组PI3K-III蛋白表达量显著高于非雷帕霉素组(P<0.01),雷帕霉素肾IRI组PI3K-III蛋白表达量于1h、12h、24h显著高于非雷帕霉素组(P<0.01),于3h、6h显著低于非雷帕霉素组(P<0.05),雷帕霉素肾IRI+HBO组于1h、3h、12h、24h时PI3K-III蛋白表显著高于非雷帕霉素组(P<0.05),雷帕霉素肾IRI+HBO组于6h PI3K-III蛋白表显著低于非雷帕霉素组(P<0.05)。(4)PKC:主要表达于主要表达于肾小球和肾小管间质。相对定量结果显示:(1)在非雷帕霉素HBO+肾缺血组、肾缺血组、假手术组及正常对照组之间PKC蛋白表达量无显著差异。在雷帕霉素假手术组PKC蛋白表达量与正常对照组无显著差异;肾缺血组PKC蛋白表达量显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01);HBO+肾缺血组PKC蛋白表达量与正常对照组和假手术组无显著差异,HBO+肾缺血组PKC蛋白表达量显著低于肾缺血组(P<0.01)。在在非雷帕霉素和雷帕霉素肾IRI组于3h、6h、12h时PKC蛋白表达量显均著高于正常对照组、假手术组及肾缺血组(P<0.01),24h时PKC蛋白表达量显著低于正常对照组、假手术组及肾缺血组(P<0.01);肾IRI+HBO组于3h、6h、12h时PKC蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01);肾IRI+HBO组于3h、6h、12h时PKC蛋白表达量显著低于肾IRI组(P<0.01),24h时PKC蛋白表达量显著高于肾IRI组(P<0.01);假手术组内各时间点PKC蛋白表达量无显著差异;肾IRI组和肾IRI+HBO组组内各时间点PKC蛋白表达量有显著差异(P<0.01),且随着时间的延长,PKC蛋白表达量逐渐增加,于6h达最高,后随着时间延长,逐渐降低,于24h达最低。(2)在非雷帕霉素和雷帕霉素组之间:雷帕霉素正常对照组、假手术组及HBO+肾缺血组PKC蛋白表达量与非雷帕霉素组无显著差异,雷帕霉素肾缺血组和肾IRI组于1h、3h、6h、12h时PKC蛋白表达量显著高于非雷帕霉素组(P<0.05),雷帕霉素肾IRI+HBO组于3h时PKC蛋白表达量显著低于非雷帕霉素组(P<0.01),雷帕霉素肾IRI+HBO组于24h时PKC蛋白表达量显著高于非雷帕霉素组(P<0.01)。(5)Atg-4:主要表达于主要表达于肾小管上皮细胞胞浆。相对定量结果显示:(1)在非雷帕霉素假手术组Atg-4蛋白表达量与正常对照组无显著差异;肾缺血组和HBO+肾缺血组Atg-4蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01),HBO+肾缺血组Atg-4蛋白表达量显著低于肾缺血组(P<0.01)。在雷帕霉素正常对照组、假手术组及HBO+肾缺血组之间的Atg-4蛋白表达量与无显著差异;肾缺血组Atg-4蛋白表达量显著低于正常对照组、假手术组(P<0.01);HBO+肾缺血组Atg-4蛋白表达量显著高于肾缺血组(P<0.01)。非雷帕霉素肾IRI组Atg-4蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01),肾IRI组Atg-4蛋白表达量显著低于肾缺血组(P<0.01)。雷帕霉素肾IRI组于1h、3h时Atg-4蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01),6h、24h时Atg-4蛋白表达量显著低于正常对照组、假手术组(P<0.01)。非雷帕霉素肾IRI+HBO组Atg-4蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01),肾IRI+HBO组于1h、6h、12h时Atg-4蛋白表达量显著高于肾IRI组(P<0.01),肾IRI+HBO组于3h、24h时Atg-4蛋白表达量显著低于肾IRI组(P<0.01)。雷帕霉素肾IRI+HBO组于1h、3h、6h时Atg-4蛋白表达量显著低于正常对照组、假手术组(P<0.01),24h时Atg-4蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组(P<0.01)。在非雷帕霉素和雷帕霉素假手术组内各时间点Atg-4蛋白表达量无差异。非雷帕霉素肾IRI组内各时间点Atg-4蛋白表达量有显著差异(P<0.01),随着时间延长Atg-4蛋白表达量逐渐增高,于3h达最高,后随着时间延长逐渐降低。雷帕霉素肾IRI组内1h时Atg-4蛋白表达量显著高于3h、6h、12h、24h(P<0.01),随着时间延长逐渐降低,与6h达最低,12h、24h时Atg-4蛋白表达量显著高于6h。在非雷帕霉素和雷帕霉素肾IRI+HBO组内各时间点Atg-4蛋白表达量有显著差异(P<0.01),呈逐渐降低的趋势,于24h达最低。(2):在非雷帕霉素和雷帕霉素组之间:雷帕霉素正常对照组和假手术组各时间点Atg-4蛋白表达量均显著高于非雷帕霉素组(P<0.01),雷帕霉素各组Atg-4蛋白表达量均显著低于非雷帕霉素组(P<0.01)。5.Western blot检测肾组织LC3-II蛋白的表达变化(1)在非雷帕霉素和雷帕霉素组均可见假手术组LC3-II蛋白表达量与正常对照组无显著差异。非雷帕霉素肾缺血组和HBO+肾缺血组LC3-II蛋白表达量显著高于正常对照组和假手术组(P<0.05),HBO+肾缺血组LC3-II蛋白表达量显著高于肾缺血组(P<0.05)。雷帕霉素肾缺血组和HBO+肾缺血组LC3-II蛋白表达量显著低于正常对照组和假手术组(P<0.01),HBO+肾缺血组LC3-II蛋白表达量与肾缺血组无显著差异。非雷帕霉素肾IRI组LC3-II蛋白表达量显著高于正常对照组和假手术组(P<0.01),肾IRI于3h时LC3-II蛋白表达量显著低于肾缺血组(P<0.01)。雷帕霉素肾IRI组LC3-II蛋白表达量显著低于正常对照组、假手术组及肾缺血组(P<0.05)。在非雷帕霉素和雷帕霉素肾IRI+HBO组各时间点LC3-II蛋白表达量显著高于正常对照组、假手术组及肾IRI组(P<0.05);假手术组内各时间点LC3-II蛋白表达量无显著差异;肾IRI组内和肾IRI+HBO组内各时间点LC3-II蛋白表达量有显著差异(P<0.01),且随着时间延长,LC3-II蛋白表达量逐渐增高,于24h达最高。(2)在非雷帕霉素和雷帕霉素组之间:雷帕霉素各组LC3-II蛋白表达量均显著高于非雷帕霉素组(P<0.05)。6.SCr和LC3-II的相关性分析相关分析显示,小鼠SCr值与肾组织LC3-II蛋白表达量的相关系数,在非雷帕霉素组为r=0.7156,在雷帕霉素组为r=0.6719,P值均小于0.01,均存在正相关关系。结论:1.HBO预处理对肾缺血损伤起保护作用。2.早期HBO治疗能够减轻肾IRI,随着时间延长,HBO的保护效应减弱。3.自噬的激活加重了肾IRI,HBO治疗在保护肾IRI的同时也激活了自噬,HBO治疗在肾IRI中发挥了双重作用。4.在肾IRI中,HBO治疗主要通过和Beclin1-Atg14-Vps34-Vps15信号通路激活自噬。5.在肾IRI中,随着时间的延长,HBO治疗对自噬的诱导越来越明显,这是肾IRI后期HBO治疗保护作用衰减的重要原因,同时这也是HBO治疗在肾IRI中发挥的双重效应。