刺五加各部位差异性成分分析及金丝桃苷氧化损伤保护机制研究

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伴随着老龄化现象的不断加重,神经退行性疾病的发病率逐年持续上升,尤其是阿尔茨海默氏病(AD),帕金森氏病(PD)和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)等疾病,据预测在不久的将来,阿尔兹海默症将成为继癌症和心脏病外导致老年人死亡的第三大原因。虽然每年用于神经退行性疾病的医疗费用和支出十分庞大,但是目前并不存在明确用于治疗该疾病的方法。氧化应激损伤作为神经退行性疾病的突破口之一近些年受到广泛关注,体内氧化和抗氧化系统失衡是导致氧化应激的诱因,氧化应激损伤将产生大量的自由基,原本就容易被损伤的神经元对自由基十分敏感,所以改善氧化应激损伤与神经退行性疾病的治疗有密切关系。五加科刺五加富含各种皂苷、黄酮、多糖、生物碱,酚酸用于脑缺血再灌注损伤、血小板聚集、抑郁、帕金森、小脑萎缩等中枢神经系统疾病方面的研究广泛,但是其发挥药效的物质基础以及作用机制尚不明确。本实验从体外实验入手,利用PC12细胞建立H2O2诱导的氧化应激损伤模型,然后研究刺五加与氧化应激损伤的保护作用之间的关系。以下是本实验的各部分内容:1刺五加不同浓度醇提取物和水提物对H2O2诱导的PC12大鼠嗜铬瘤细胞氧化应激损伤的干预作用利用与神经元细胞具有形态功能高度相似性的大鼠嗜铬瘤细胞PC12细胞作为实验对象,建立H2O2氧化应激损伤模型,利用外源性MTT与活细胞反应生成不同深度的蓝紫色结晶的吸光值可以反映细胞相对存活率的方法,首先确定H2O2半抑制浓度为400μm/L作为实验模型浓度,然后确定了刺五加30%醇提取物、70%醇提取物、95%醇提取物和水提取物的最佳给药剂量,按照最佳给药剂量对PC12细胞预给药12小时后,给予400μm/L的H2O2损伤12小时检测到除95%醇提物干预对H2O2损伤的PC12细胞没有保护作用外,其余浓度醇提取物和水提取物均有不同程度的保护作用,其中70%的醇提取物对H2O2氧化应激损伤保护作用最明显。所以下一步我们将应用超高效液相色谱——四极杆飞行时间质谱联用技术对70%醇提刺五加进行代谢产物的分析。2不同部位刺五加差异标志物及其抗氧化应激损伤相关性分析传统刺五加用药部位多位根茎,但是刺五加籽和刺五加叶在药效学方面也有相关研究报道,本章节实验采用了超高效液相色谱——四极杆飞行时间质谱联用技术(Ultra High Performance Liquid Tandem Chromatography Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry,UHPLC-QTOF-MS)对不同部位70%醇提取刺五加各10批次进行化学成分分析鉴定并筛选其不同部位(根茎、籽、叶)的差异性成分作为差异标志物,采用MTT比色法对不同部位所有批次样本进行抗H2O2氧化损伤PC12细胞干预的结果进行检验,最后通过皮尔森相关性分析将刺五加不同部位的差异标志物结果与其对应部位的抗H2O2氧化损伤结果进行关联,寻找刺五加不同部位中与抗氧化应激损伤相关的物质基础。通过鉴定分析,刺五根茎中与抗氧化应激损伤相关性高的物质有Syringic acid、Eleutheroside E、Quercetin等物质11个,刺五加籽中有Chlorogenic acid、Hyperoside、Astragalin等19个物质,刺五加叶中p-Coumaric acid、L-Phenylalanine、Azelaic acid等19个物质均与抗H2O2氧化应激损伤PC12细胞的作用有显著相关。其中这些物质中11个在氧化应激损伤或者抗氧化方向的作用在之前的研究中均有不同程度的报道,其中包含Astragalin、Chlorogenic acid、p-Coumaric acid、Quercetin、Rutin是对H2O2诱导的PC12细胞有保护作用的,在这些与保护H2O2诱导的PC12细胞有显著性相关的差异标志物质中,我们选择了在刺五加籽和刺五加叶中均有显著性的抗氧化应激损伤相关性的物质金丝桃苷(Hyperoside)这个刺五加中含量较高的黄酮类成分探索其对H2O2诱导的PC12细胞的保护作用及其相关机制。3.金丝桃苷对H2O2诱导PC12氧化应激损伤保护作用机制研究金丝桃苷作为刺五加中主要的黄酮类活性物质之一,在叶中含量最多,其在氧化损伤的治疗,炎症凋亡的减轻作用上均有不同程度的相关报道,所以作为一个存在神经修护作用潜能的单体药物极具开发价值,本章节实验首次研究了金丝桃苷作用于H2O2损伤的PC12细胞的保护作用及其机制研究,利用MTT比色法确定了金丝桃苷保护PC12氧化应激损伤的最佳干预浓度为50μm/L,给予50μm/L金丝桃苷干预H2O2氧化应激损伤前后pi3k、Akt LC3Bm RNA和蛋白表达均显著上调而P53、Bax、Caspase 3、NF-κB、i NOS、P62、m RNA和蛋白表达均呈现显著下调趋势,pi3k/Akt通路参与细胞增殖分化生长的调节,同时可以保护毒性损伤的神经细胞,该通路的激活会使得Akt出现级联磷酸化而抑制氧化应激损伤,同时Akt的活化将激活该信号通路的下游因子NF-κB、P53、Bax等蛋白的表达,同时NF-κB调控钙调蛋白非依赖性酶i NOS合成与调控细胞色素C的释放以及Caspase相关蛋白的激活,而氧化损伤引起应激反应会作用于P53使其表达水平上升,P53激活后带动其下游基因Bax的上调进而激活固有的凋亡途径;pi3k/Akt通路除了参与细胞凋亡调节还会通过调节自噬清除神经退行性疾病中的蛋白聚集,与自噬的选择底物蛋白P62和LC3B共定位和免疫功沉淀参与自噬体的形成。从以上实验可以验证金丝桃苷对H2O2损伤的保护作用主要通过调控与自噬和凋亡相关的通路实现,而凋亡与自噬是关系密切之间相互反馈共同调控细胞存活生长。本实验通过代谢组学技术筛选鉴定出不同部位刺五加中差异性化学成分,将差异性化学成分代谢组学结果与该部位样本对应的氧化损伤保护作用结果进行相关性分析,找寻不同部位刺五加差异标志物和其药效相关物质基础,从新的角度探索刺五加治疗氧化应激损伤机制,为神经退行性疾病治疗方向以及刺五加治疗作用机制提供了参考思路和研究基础。
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