SuhB影响铜绿假单胞菌耐药性的机制研究

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铜绿假单胞菌是一种医院常见的重要的条件致病菌,它可以感染许多免疫系统有缺陷病人,如肺部囊性纤维化(CF)、艾滋病(AIDS)、烧伤和癌症等病人。铜绿假单胞菌所携带的一系列的毒性基因是其致病性的基础。对这些毒性基因的功能和调控的研究有助于我们了解铜绿假单胞菌的致病过程,并针对这些功能和过程设计新的治疗方法和新型药物。铜绿假单胞菌引起的感染可以分为:急性感染和慢性感染。三型分泌系统(T3SS)和运动能力与急性感染有关,生物被膜和六型分泌系统(T6SS)与慢性感染有关。铜绿假单胞菌有着非常复杂的调控系统。到目前为止,已经有690个调控因子被鉴定出来,其中LasR,MexT,Fur,AlgW,RhlR,PtrR,Ihf,Vfr,AlgR和Anr这10个全局调控因子已经被详细研究过。实验室在前期研究中发现,铜绿假单胞菌一个被称命名为 suhB(PA3818)的基因,对铜绿假单胞菌的急性和慢性感染都有着调节作用。根据前期的研究结果显示, SuhB极有可能像 LasR, MexT,Fur,AlgW,RhlR,PtrR,Ihf,Vfr,AlgR和 Anr一样是一个全局性的调控因子。本研究从此思路出发,首先测定了PAK,PAKΔsuhB, PAKΔsuhB-suhB回补株对庆大霉素(Gm),新霉素(Neo),环丙沙星(Cip),四环素(Tc),羧苄青霉素(Cb),红霉素(Er)的最小抑菌浓度。PAKΔsuhB菌株相对于 PAK菌株对氨基糖苷类的新霉素(Neo)和庆大霉素(Gm),喹诺酮类的环丙沙星(Cip)的耐药性升高。对大环内酯类的红霉素(Er),四环素类的四环素(Tc)的耐药性保持不变,对β-内酰胺类的羧苄青霉素类(Cb)的耐药性降低。  本文利用real time RCR对铜绿假单胞菌抗药性相关的一些基因在转录水平上进行了研究。结果表明PAKΔsuhB菌株中外排泵基因mexC,mexP,mexJ,mexX, mexY,mexE,mexH都升高了。其中mexX上升的倍数最高。铜绿假单胞菌有12个 RND家族的外排泵系统,mexXY是其大家族成员中的一员。实验室前期对PAKΔsuhB菌株进行的转录组测序也表明mexX表达上升。在此基础上,我们做了接下来的研究,SuhB是通过何种机制影响了MexXY这个外排泵系统。MexXY外排泵的底物主要包括氨基糖苷类抗生素,喹诺酮类抗生素,四环素,氯霉素,大环内酯类抗生素等。其中氨基糖苷类抗生素,喹诺酮类抗生素是其最主要的底物。通过构建mexX基因的转录融合和mexX基因的翻译融合,再次通过real time RCR确定了mexX,在PAKΔsuhB菌株中表达情况,以及通过敲除mexXY测定菌株对抗生素的最小抑菌浓度。这部分结果表明PAKΔsuhB菌株耐药性的升高是由于MexXY的高表达所引起。铜绿假单胞菌对mexXY的调节主要通过RarRS双组份系统和PA5471来实现。通过real time RCR对parRS和PA5471基因在转录水平进行了测定,通过构建PA5471的翻译融合以及敲除PA5471后测定最小抑菌浓度(MIC)。这部分结果表明PA5471的高表达引起MexXY的高表达。PA5471主要受到前导肽PA5471.1的调节,通过在PAK,PAKΔsuhB菌株中敲除PA5471.1和点突变PA5471.1,我们证明了PA5471在PAKΔsuhB菌株的高表达是由依赖于PA5471.1。PA5471.1是一个翻译抑制子,它的功能是通过核糖体的停靠位置使其形成不同的结构来实现的。通过氨基糖苷类抗生素的诱导实验表明在 PAK菌株中 PA5471能够被诱导表达,但是在 PAKΔsuhB菌株中PA5471不能被诱导表达。因此我们推论是由于SuhB影响了核糖体的功能从而引起PA5471.1的变化,来使得PA5471高表达,PA5471又使得MexXY的高表达,从而使得PAKΔsuhB菌株对氨基糖苷类抗生素的抗性升高。
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