背景口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,发病率在全身恶性肿瘤中占第六位。而口腔癌中最多的是鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC),占90%以上。口腔鳞状细胞癌的发生发展是一个渐进的过程,从正常口腔黏膜发展到口腔癌,组织学上需要经过上皮单纯性增生、上皮异常性增生、原位癌、浸润癌等阶段。患者就诊时一般已经到达癌症晚期,虽然可以应用手术、化疗以及放疗等手段取得疗效,但对于患者已经造成不可修复的损伤,破坏口腔颌面部的组织和功能,严重的伤害到病人的生理和心理的健康。因此,如何早期发现口腔黏膜的异常并针对其改变做到早期治疗尤为重要,也是口腔癌研究方向上的一个重点。流式细胞术(Flow cytometry,FCM)起源于20世纪70年代,它是对单细胞定量分析的一种新技术。流式细胞术现在运用最为广泛的领域有免疫学,血液学,肿瘤学及细胞凋亡学等。流式细胞仪可以检测DNA含量以及恶变细胞的异倍体。把瘤体组织解聚离散,制备成单细胞悬液,然后用荧光染料嵌入DNA,使DNA显影,通过计算机对细胞DNA的含量进行分析。正常的体细胞都是二倍体,但肿瘤中常常会出现异倍体,包括四倍体及非整倍体,肿瘤的染色体数目和结构会发生异常,产生细胞增殖失控,这是恶性肿瘤的一个重要特征。有许多学者报道,流式细胞仪诊断恶性肿瘤的正确率高达90%以上。恶性肿瘤的标志之一就是细胞无限增殖。核仁组织区(NOR)是位于染色体上的DNA片段,含有rRNA基因,能够参与细胞核的形成,并且是rRNA转录活动的标志,能够反映细胞核的结构和功能的改变。核仁组织区含有核仁形成区嗜银蛋白,能与银离子结合并显色,能通过计算机计数很好的判定细胞的增殖状态。目的本实验采用化学方法诱导大鼠口腔癌模型,再结合流式细胞仪和银染核仁组织区的方法进行辅助诊断,并对这两种方法进行评价,寻求一种更为有效的检测口腔黏膜癌变的方法,为人类口腔癌的早期诊断打下基础。方法1.建立动物模型,实验组63只Wistar大鼠平均分配,每笼7只,共9笼。用棉签蘸取0.5%4NQO水溶液涂抹腭部黏膜,每隔一天涂一次,连续涂28周。对照组不做任何处理,从实验开始第4,8,12,16,20,24,28周各从实验组中随机处死9只大鼠,同时处死一只对照组大鼠。2.在建模过程中,从第4周开始,每次处死动物前,用细胞刷刷取大鼠腭部可疑病变区,收集细胞,制备细胞悬液,做流式细胞术检测。随后处死动物,切取腭部组织,放到福尔马林液中固定,酒精梯度脱水,石蜡包埋,常规切片,做HE染色,树胶封片,显微镜观察。另取一张切片做硝酸银染色,做银染核仁组织区颗粒计数。3.判断标准：流式细胞术检测判断标准：以正常大鼠腭部口腔黏膜为参照,其细胞DNA为二倍体,DNA指数为1.0,由计算机软件获得实验组各样本DNA指数,在1.0±0.1之外的数字,表示该样本含有DNA异倍体,异倍体率也有计算机软件自动生成。大鼠口腔黏膜病变判断标准：大鼠口腔黏膜病理改变上皮异常增生和口腔癌的分级参照WHO(1996,1997)标准。银染核仁组织区判断标准：按照1995年11月“关于核仁组织区(AgNOR)研究工作的标准化方案”计数每个细胞核内银染颗粒总数,然后换算成每个细胞核AgNOR的平均数,同时在进行核内颗粒形态观察。4.应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,取a=0.05为检验标准。并对两种实验方法做线性相关性分析。结果1.动物模型的建立：随着致癌剂涂抹时间的延续,大鼠腭部黏膜相继产生白色增厚、颗粒样增生、溃疡、糜烂等改变。第4周大鼠黏膜均为上皮单纯性增生；第8周55.6%为单纯增生,44.4%的大鼠为轻度异常增生；到第12周,有22.2%的大鼠腭部黏膜为轻度异常增生,55.6%的是中度异常增生,还有22.2%的是重度异常增生；到第16周有44.4%的大鼠腭部黏膜为中度异常增生,55.6%的为重度异常增生；第20周11.1%为中度异常增生,77.8%为重度异常增生,11.1%为原位癌；第24周55.6%为重度异常增生,33.3%为原位癌,11.1%为浸润癌；第28周,22.2%为原位癌,77.8%为浸润癌。2.流式细胞术检测法对重度异常增生,原位癌以及鳞癌的敏感性很高,达78.6%,与细胞核银染检测法具有正相关关系。结论1使用4NQO水溶液涂抹Wistar大鼠腭部黏膜可以建立动物口腔癌模型,并且动物模型的癌变过程与人类相似。口腔癌的发生发展过程经历了正常黏膜→上皮单纯性增生→轻度异常增生→中度异常增生→重度异常增生→原位癌→浸润癌。2流式细胞仪检测细胞DNA含量和银染核仁组织区这两种方法可以作为口腔癌诊断的辅助手段。两种方法相结合可以提高口腔黏膜病变的检出率。